论文部分内容阅读
第一部分TSHR在正常组织和分化型甲状腺癌（DTC）中的表达评估目的:近年来,嵌合抗原受体（Chimeric antigen receptor,CAR）修饰的T细胞（CAR-T）治疗在血液系统恶性肿瘤中的成功应用,彻底颠覆了传统的肿瘤免疫治疗模式。然而,该疗法在实体瘤中却进展缓慢,其中最主要的原因是缺乏合适的肿瘤特异性抗原（Tumor specific antigen,TSA）作为治疗的靶点。将CAR-T技术应用于甲状腺癌有着其他实体瘤不可比拟的优势,即多数病人在初次治疗时已经摘除了甲状腺,因此在靶点设计上可以选择甲状腺组织特异性膜蛋白,如促甲状腺激素受体（Thyroid stimulating hormone receptor,TSHR）。本部分研究旨在全面评估TSHR在人体正常组织器官、DTC组织及细胞系中的表达情况,为靶向TSHR的CAR-T细胞治疗DTC的安全性和可行性提供理论依据。方法:首先通过检索GTEx、GEPIA、HPA、GEO及CCLE数据库,初步了解TSHR在人体健康组织及DTC组织中的表达。接着,收集189例DTC原发灶、57例正常甲状腺对照组织、23例颈部淋巴结转移灶、15例碘抵抗（Radioactive iodinerefractory,RAI-R）甲状腺癌、15例眼眶后脂肪及纤维组织、3例胫骨前皮下组织,以及一个多器官正常组织芯片,通过免疫组化染色评估TSHR的表达。最后,通过免疫荧光和流式细胞术检测了DTC及甲状腺滤泡上皮细胞系中TSHR的表达情况。结果:通过生物信息学和免疫组化分析发现,TSHR在除了甲状腺外的绝大多数正常组织中表达缺失,仅在部分样本的胃粘膜上皮细胞和膀胱上皮细胞呈低强度表达。而在癌组织中,TSHR在甲状腺乳头状癌（Papillary thyroid carcinoma,PTC）、甲状腺滤泡状癌（Follicular thyroid carcinoma,FTC）和颈部淋巴结转移灶中的阳性率分别为90.8%,89.2%和78.2%。PTC的各亚型中,经典型和滤泡变异型的TSHR表达阳性率最高,分别为93.8%和93.7%。高细胞变异型、钉突变异型、透明细胞变异型和柱状变异型阳性率稍低,依次为85%、90.9%、75%和50%。在RAIR-DTC的局部复发病灶和颈部淋巴结中均存在TSHR的阳性表达,总体阳性率达86.7%。最后,流式细胞术和免疫荧光结果表明,TSHR在DTC细胞系中的表达普遍缺失或明显下降。结论:本研究结果表明,TSHR在除了甲状腺外的大多数正常组织中表达缺失,同时在各种病理亚型DTC中普遍表达,证明了TSHR作为DTC的CAR-T治疗靶点的安全性和可行性,为后续进行靶向TSHR的CAR-T治疗的研究提供了前提和理论支持。第二部分靶向TSHR的CAR-T细胞构建及体外功能实验目的:分化型甲状腺癌（DTC）是最常见的甲状腺癌病理类型,占全部甲状腺恶性疾病发病率的95%。虽然DTC病人经过正规的手术、131碘、TSH抑制治疗后,多数预后良好,但仍有一部分病人出现疾病的进展。由于DTC对传统的化疗和放疗均不敏感,小分子抑制剂的靶向治疗药物又存在耐药率高、副反应严重的缺陷,晚期DTC病人往往面临着无药可医的局面。近年来,CAR-T细胞治疗因其识别肿瘤抗原无须主要组织相容性复合体（Major histocompatibility complex,MHC）限制,同时可以通过增加共刺激分子信号发挥强有力的抗肿瘤效应而备受瞩目。然而,目前尚无关于DTC的CAR-T细胞治疗的报道。因此,本部分研究旨在开发一种靶向DTC的CAR-T治疗模式,探究以TSHR为靶点CAR-T细胞的体外杀伤效应、炎症因子分泌能力及张力性信号激活能力。方法:利用三种人TSHR单克隆抗体（M22、K1-18和K1-70）构建第三代CAR慢病毒（22-CAR、18-CAR和70-CAR）。分离健康志愿者外周血淋巴细胞,通过磁珠分选T淋巴细胞,利用构建好的CAR慢病毒感染T细胞。通过乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase,LDH）和萤火虫荧光素酶（Firefly luciferase,Fluc）细胞毒性实验、酶联免疫吸附试验（Enzyme immunosorbent assay,ELISA）、流式细胞术等评估三种CAR-T细胞的体外杀伤、炎症因子分泌、特异性增殖以及张力性信号激活的能力。结果:本研究成功构建了三种靶向TSHR的第三代CAR载体,并通过慢病毒使其稳定地表达于T细胞表面。LDH释放实验和Fluc毒性实验表明,三种CAR-T细胞均可以在体外有效杀伤TSHR阳性的DTC细胞并分泌大量的IL-2和IFN-γ。70-CART细胞相比于22-CAR和18-CAR-T细胞,展现出更低的张力性信号的激活能力,表现为CD3/CD28抗体单轮刺激后,更短的倍增时间、激活后更快的体积回缩能力、更低的凋亡细胞比例以及更多的低分化的CD8+T细胞。结论:本研究证实了以M22、K1-18和K1-70单克隆抗体为基础构建的第三代CART细胞可以在体外有效识别并杀伤TSHR表达阳性的DTC细胞。70-CAR相比于另外两种CAR结构在张力性信号激活能力方面表现更佳,这将有利于其在体内发挥良好的抗肿瘤作用。第三部分免疫缺陷小鼠皮下异种移植瘤模型评估靶向TSHR的CAR-T细胞的有效性和安全性目的:体外实验虽然可以提供关于CAR-T细胞短期内杀伤效果、炎症因子分泌能力的信息,但其无法模拟体内的肿瘤微环境。因此,动物实验是评价CAR-T细胞临床前疗效的重要手段和必不可少的指标之一。CAR-T细胞的体内疗效评估通常使用NOD Scid Gamma（NOD.Cg-PrkdcscidIL-2rgtm1Wjl/Sz J,NSG）鼠作为造模小鼠。该品系小鼠具有重度免疫缺陷表型,被广泛应用于过继性细胞免疫治疗的评估中。用CAR-T细胞治疗带有人类肿瘤的NSG小鼠,可以用来分析CAR-T细胞的抗肿瘤功效、体内存活能力及治疗的安全性。因此,本部分研究旨在通过NSG小鼠皮下异种移植瘤模型评价靶向TSHR的CAR-T细胞治疗的疗效及安全性。方法:选取6-8周龄NSG小鼠进行皮下接种稳定过表达Fluc和TSHR蛋白的K1细胞系（K1-TSHR-Luc）。肿瘤种植成功后,尾静脉注射70-CAR-T细胞或未转导病毒的T（NT）细胞或PBS。通过小动物活体成像监测各组小鼠肿瘤大小变化,通过流式细胞术检测小鼠体内T细胞增殖情况,通过器官解剖体外成像判断各组小鼠远处转移情况,通过检测体重、HE染色及免疫组化评估治疗的安全性。结果:相比于注射NT细胞和PBS组小鼠,70-CAR-T细胞可以有效抑制K1-TSHRLuc在体内的生长,同时控制小鼠肺转移灶的形成。流式细胞术结果表明,70-CART组小鼠体内的人CD3+T细胞随着治疗时间的延长而不断增殖。最后,HE染色、免疫组化染色及小鼠体重监测结果提示,70-CAR-T细胞治疗对小鼠无明显的毒副作用。结论:本研究通过小鼠模型证明了70-CAR-T细胞治疗的体内有效性、持续性和安全性。靶向TSHR的CAR-T细胞治疗或可成为DTC术后,特别是复发转移的DTC及RAI-R甲状腺癌的新的治疗策略。