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背景:近年来,肿瘤的免疫疗法越来越受到人们的重视。其中,嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）和免疫检查点抑制剂型抗体为代表的肿瘤免疫治疗技术所表现出的巨大潜力和优势,给更多的肿瘤患者带来了希望。嵌合抗原受体的T细胞（也称为CAR-T细胞）是工程化的T细胞,使其表达能够靶向识别肿瘤相关抗原的单链抗体,从而更有效地靶向和破坏癌细胞。PD-1（程序性死亡受体1）是一种重要的免疫抑制分子,它存在于T细胞表面,肿瘤表面高表达PD-1的配体（PD-L1和PD-L2）,其配体与T细胞的PD-1的结合,可导致T细胞的程序化死亡,从而使得肿瘤细胞逃避免疫系统的监视攻击。T细胞受体（TCR）是一个固定在细胞膜上的异源二聚体,由两个不同的亚基所构成。95%的T细胞的受体由高度易变的α亚基和β亚基通过二硫键连结构成。这一类T细胞被称为αβT细胞。另外5%的T细胞受体含有γ亚基和δ亚基,这群T细胞被称为γδT细胞,主要分布在皮肤和黏膜组织。γδT细胞不仅对肿瘤细胞具有毒性作用,更独特之处在于它可以直接识别抗原,而不需抗原提呈细胞（APC）的提呈。高尔基体驻膜糖蛋白73（GP73）,也被称为高尔基体膜蛋白I（GOLM1）或高尔基体磷蛋白2（GOLPH2）,是位于高尔基体上的Ⅱ型跨膜糖蛋白。GP73在肝癌癌症组织中高表达,是一个重要的肿瘤标志物。目的:本课题旨在探索一种诱导分化培养高纯度的γδT细胞的方法,并将GP73单链抗体、PD-1免疫检查点阻断以及γδT细胞三联合,探索构建靶向GP73的CAR-γδT细胞的方法,并探讨PD-1--GP73 CAR-γδT细胞体外增殖活性,为探索PD-1--GP73 CAR-γδT细胞对肝癌的杀伤作用打下基础,为肝癌的免疫治疗提供新策略方法。方法:1、使用间接免疫荧光和流式细胞术检测肝癌细胞系（Hep G2、SMMC-7721、MHCC97H）中GP73的表达情况;使用裸鼠构建不同肝癌细胞系（Hep G2、SMMC-7721、MHCC97H）的同种异体肿瘤模型,通过免疫组化实验检测GP73的在不同肝癌组织中GP73的表达情况。2、在北京可瑞公司构建含GP73 CAR的Donor质粒:（1）合成GP73特异性sc Fv序列;（2）将CD8引导区（lead sequence）、sc Fv序列、CD8铰链区（CD8hinge）、CD8跨膜区、CD28胞内区、4-1BB胞内区和人CD3ζ链胞内区串联拼接,形成三代CAR的功能序列后,插入EF-1a启动子之后;（3）为了监测CAR的敲入和表达效率,在CD3ζ序列后,使用T2A序列串联m Cherry;（4）基于非同源重组末端插入技术（homology-independent targeted integration,HITI）构建CRISPR knockin的供体质粒,在CAR-m Cherry的片段两侧联入PD1sg RNA或者AAVS1 sg RNA的靶序（sg RNA+PAM）;（5）将上述PD1 sg RNA-EF1α-GP73-CAR-T2A-m Cherry-PD1 sg RNA片段和AAVS1 sg RNA-EF1α-GP73-CAR-T2A-m Cherry-AAVS1 sg RNA片段分别克隆至Donor质粒,构建成PD-1--GP73 CAR和AAVS1--GP73 CAR。3、γδT细胞的诱导与增殖。抽取健康志愿者的外周血,从中分离出外周血单个核细胞（PBMC）,并用适量浓度的唑来膦酸（zol）、IL-2和IL-15刺激PBMC中的T细胞,使其诱导分化增殖成为γδT细胞,并用流式细胞仪检测γδT细胞的纯度。4、将PD-1--GP73 CAR、AAVS1--GP73 CAR和GFP阳参质粒三种质粒,每种质粒再配合Cas9蛋白和其相应的PD-1 sg RNA或AAVS1 sg RNA,分别电穿孔转染至γδT细胞中,得到PD-1--GP73 CAR-γδT细胞、AAVS1--GP73 CAR-γδT细胞和GFP-γδT细胞,在荧光显微镜下观察转染后的γδT细胞的Cherry或GFP荧光表达情况,并使用流式细胞仪检测它们各自对应的荧光表达率。5、GP73 CAR-γδT细胞与MHCC97H细胞的体外共培养,ELISA试剂盒检测其分泌IFN-γ和TNF-α两种细胞因子含量。结果:1、MHCC97H细胞中GP73的表达率明显高于Hep G2、SMMC-7721两种肝癌细胞。2、流式细胞术结果显示PBMC经刺激培养,γδT细胞的纯度可达到84.9%,这表明适量的唑来膦酸（zol）、IL-2和IL-15可诱导T细胞分化成为γδT细胞,并使其大量增殖。3、电穿孔转染后的PD-1--GP73 CAR-γδT细胞、AAVS1--GP73 CAR-γδT细胞在荧光显微镜可观察红色荧光,GFP-γδT细胞可观察到绿色荧光。流式细胞术结果显示PD-1--GP73 CAR-γδT细胞和AAVS1--GP73 CAR-γδT细胞的Cherry的表达分别为7.8%和19.9%。4、与MHCC97H细胞共培养后,PD-1--GP73 CAR-γδT细胞、AAVS1--GP73 CAR-γδT细胞、PD-1--γδT细胞和γδT细胞四组细胞分泌的IFN-γ和TNF-α两种细胞因子含量依次递减。结论:1、本课题证明了GP73蛋白在肝癌细胞系MHCC97H中高表达,因此MHCC97H细胞可作为本课题中所构建的GP73 CAR-γδT的良好靶标细胞。2、成功构建出了靶向GP73的PD-1位点敲除的CAR-γδT细胞和靶向GP73的AAVS1位点敲除的CAR-γδT细胞,即PD-1--GP73 CAR-γδT细胞和AAVS1--GP73 CAR-γδT细胞。3、PD-1位点敲除和GP73单链抗体均能促使CARγδT细胞分泌更多的IFN-γ和TNF-α细胞因子。4、GP73单链抗体、PD-1免疫检查点阻断以及γδT细胞的三联合,为肝癌的免疫治疗提供了新的策略。