近年来，嵌合抗原受体(CAR)修饰的αβT细胞免疫疗法在肿瘤免疫治疗领域取得了巨大的成就，其中CD19CAR-αβT细胞对于B淋巴系白血病的治疗最具有代表性。然而，目前依然存在众多阻碍CAR-αβT细胞广泛应用的不利因素，例如CAR-αβT细胞毒副作用大，制备失败率高、难以实现产业化等。因此本研究中，我们将研究目标聚焦在T细胞的另一个亚群上，即γδT细胞。γδT细胞是不同于αβT细胞的另一个T细胞亚群，其同时具有固有免疫细胞和适应性免疫细胞的特征。γδT细胞对抗原的识别不受MHC分子限制，因此其可被用于异体免疫治疗。根据其Vγ链和Vδ链的不同，可以将γδT细胞分为不同的亚类。其中，Vγ9Vδ2T细胞是外周血中主要γδT细胞。Vγ9Vδ2T细胞对多种肿瘤细胞具有天然的抗肿瘤活性，同时活化的Vγ9Vδ2T细胞还具专业的抗原提呈细胞(APCs)的功能，在免疫反应中具有重要作用。因此，Vγ9Vδ2T细胞是近年来异体免疫治疗的热门候选细胞之一。
　　目的:建立可用于异体免疫治疗的Vγ9Vδ2T细胞和MUC1-TnCAR-Vγ9Vδ2T(CAR-Vγ9Vδ2T)细胞体外制备方法。随后，在体外评估CAR-Vγ9Vδ2T细胞的特异性细胞毒性作用，同时比较其与和CAR-αβT细胞的细胞毒性作用及细胞功能的持久性。最后，在异种肿瘤小鼠模型上评估CAR-Vγ9Vδ2T细胞的抗肿瘤活性以及安全性。
　　方法:使用唑来膦酸(ZOL)和IL-2体外选择性扩增制备Vγ9Vδ2T细胞，建立Vγ9Vδ2T细胞的体外制备方法。设计并通过基因合成构建MUC1-TnCAR分子，并将其亚克隆到慢病毒载体。通过慢病毒转染法构建MUC1-TnCAR-Vγ9Vδ2T细胞，并使用流式染色法检测CAR-Vγ9Vδ2T细胞的阳性率。通过逆转录法和PCR扩增法等基因工程技术手段构建COSMC慢病毒载体。使用COSMC慢病毒转染JurkatT细胞使JurkatT细胞表面MUC1-Tn抗原表达消失。将JurkatT和COSMC-JurkatT细胞作为靶细胞，通过靶细胞标记流式法检测CAR-Vγ9Vδ2T细胞的特异性细胞毒性作用。通过RTCA法比较CAR-Vγ9Vδ2T细胞和CAR-αβT细胞的细胞毒性作用。此外，通过肿瘤细胞重复刺激实验对CAR-Vγ9Vδ2T细胞和CAR-αβT细胞的细胞毒性功能持久性进行比较。使用CBA法对上述细胞毒性实验中细胞培养上清液的细胞因子含量进行检测。最后，构建异种胃癌细胞NSG小鼠模型，评估CAR-Vγ9Vδ2T细胞的体内抗肿瘤活性和安全性。
　　结果:我们成功建立了Vγ9Vδ2T细胞和MUC1-TnCAR-Vγ9Vδ2T细胞的体外制备方法。我们成功恢复了JurkatT细胞的COSMC基因功能，使其细胞表面的MUC1-Tn抗原表达消失。在将JurkatT细胞和COSMC-JurkatT细胞作为靶细胞的细胞毒性研究中，CAR-Vγ9Vδ2T细胞仅对JurkatT细胞具有显著增强的细胞毒性作用，说明CAR-Vγ9Vδ2T细胞具有高度的特异性的细胞毒性作用。CAR-Vγ9Vδ2T细胞和CAR-αβT细胞的细胞毒性比较结果表明，CAR-Vγ9Vδ2T细胞具有比CAR-αβT细胞更强的细胞毒性作用，但其对肿瘤细胞持续清除能力弱于CAR-αβT细胞。后续的研究表明:IL-2的存在能够有效的改善CAR-Vγ9Vδ2T细胞细胞毒性作用和功能的持久性。进一步的CAR-Vγ9Vδ2T细胞体内抗肿瘤活性研究表明，CAR-Vγ9Vδ2T细胞能够有效的抑制肿瘤细胞生长，同时实验过程中小鼠的体重并未发生明显的变化，说明CAR-Vγ9Vδ2T细胞具有有效的抗肿瘤活性和良好的安全性。
　　结论:本研究中我们成功建立了Vγ9Vδ2T细胞和CAR-Vγ9Vδ2T细胞的体外制备方法。通过细胞毒性实验证明CAR-Vγ9Vδ2T细胞对多种肿瘤细胞均具有抗原特异性的细胞毒性作用。同时CAR-Vγ9Vδ2T细胞比CAR-αβT细胞具有更强的细胞毒性作用，但其功能持久性较弱，而加入IL-2可以有效的改善这一缺陷。另外，异种小鼠肿瘤模型体内实验结果也表明CAR-Vγ9Vδ2T细胞具有良好的抗肿瘤活性及安全性。因此，CAR-Vγ9Vδ2T细胞有望成为一种新型的、极具前景的异体肿瘤免疫疗法。