反刍动物瘤胃中的甲烷菌利用饲料发酵过程中生成的氢和CO2作为主要的电子受体和供体通过还原反应生成甲烷,在瘤胃功能性生态生境中发挥重要作用。除甲烷菌以外,其他瘤胃微生物也影响甲烷产量。瘤胃微生物总体来说可分为产氢微生物和耗氢微生物两大类。通过构建克隆文库等现代分子生物学技术,阐述氢代谢相关微生物数量和多样性,并着重研究瘤胃内与降低甲烷产生过程密切相关的耗氢微生物区系结构,从微观角度研究添加延胡索酸盐对湖羊瘤胃氢代谢相关菌群结构的影响。第一部分延胡索酸二钠添加对湖羊瘤胃发酵和微生物区系总体变化趋势的影响本部分通过体外和体内试验研究胡索酸二钠添加对湖羊瘤胃发酵和微生物区系的研究。大量研究已证实茶皂素能够减少瘤胃内氢产生菌(原虫)数量和活性,而延胡索酸钠能提高瘤胃内氢利用菌的数量和活性(延胡索酸还原菌),推测两者混合添加能从两方面降低瘤胃内氢压,从而起到降低瘤胃甲烷产量的作用。通过体外茶皂素和延胡索酸二钠的混合添加试验,发现茶皂素和延胡索酸钠混合添加时,对产气量、甲烷产量和乙酸丙酸比有良好的互作效果。在此基础上了进行湖羊试验,结果发现,添加延胡索酸二钠30g/d连续饲喂6周,发现最后一周时丙酸显著增加。同时发现延胡索酸二钠添加显著降低了甲烷菌(氢利用菌)数量、提高了主要纤维降解细菌(氢产生菌)R. albus和延胡索酸还原菌F. succinogenes的数量,同时对真菌(氢产生菌)也有促进作用。DGGE分析发现DGGE分析发现,随着延胡索酸二钠的添加细菌区系有从拟杆菌门变为壁厚菌门的趋势。第二部分添加延胡索酸二钠对湖羊瘤胃细菌菌群结构的影响本部分取上述试验中的0周(对照组)和6周(处理组)的瘤胃液样品构建16S rRNA基因总菌文库,探讨了添加延胡索酸二钠对湖羊瘤胃细菌菌群结构的影响。结构发现对照组文库共255个克隆中有73%的克隆属于拟杆菌门(Bacteroidetes),24%的克隆属于壁厚菌门(Firmicutes).而延胡索酸处理组共231个克隆中有10%的克隆属于壁厚菌门,82%的克隆属于拟杆菌门,还有4%的克隆属于proteobacteria(蛋白分解菌门),推测蛋白分解菌门在延胡索酸还原过程中起着关键作用。对照组菌群(OTU)个数为75个,添加后增加为153个。两个文库合并分析共得到208个valid OTUs。两个文库的coverage值分别是79%和51%。说明处理组还有很多新的菌群尚未发现。在处理组中还发现12个序列属于Butyrivibrio(丁酸弧菌属),其中有3个克隆属于Butyrivibrio fibrisolvens(溶纤维丁酸弧茵),同源性为93%。还有8个序列属于Butyrivibrio hungatei(亨氏丁酸弧菌),相似性为99%。剩下9个属于Butyrivibrio proteoclasticus,相似性为95%。而对照组中只发现2个序列属于丁酸弧菌属(id=95%)。可见延胡索酸添加促进了丁酸弧菌属的生长,说明这个属的菌在延胡索酸代谢途中发挥着某种积极作用。作为纤维分解菌和丁酸生成菌Butyrivibrio fibrisolvens的增加,表明添加延胡索酸钠盐后提高了纤维降解能力。另外还发现对照组中有163个克隆属于Prevotella属的细菌,而处理组只有15个克隆与Prevotella相似,说明随着延胡索酸钠盐的添加Prevotella属的细菌的优势性大大降低,可能由其他与延胡索酸代谢相关的菌代替成为优势菌群。另外处理组中27个克隆属于Clostridium-like菌(id=86%),而对照组只有6个克隆与Clostridium-like菌相似(相似性为86%)。与DGGE结果对应,说明Clostridium-like菌在延胡索酸代谢途径中发挥关键作用。延胡索酸钠添加显著提高了瘤胃细菌的多样性,并在各个分类水平上显著改变了瘤胃细菌的菌群结构。第三部分添加延胡索酸二钠对湖羊瘤胃甲烷茵茵群结构的影响本部分通过构建对照组和添加延胡索酸钠盐组的瘤胃16S rRNA基因甲烷菌文库,比较mcrA文库和Archaeal 16S rRNA基因文库反映瘤胃甲烷菌结构的异同,从而结合两种文库探讨添加延胡索酸二钠是否对湖羊瘤胃甲烷菌菌群结构有影响。结果发现,mcrA文库和Archaeal 16S rRNA基因文库构建的进化树结构相似,说明mcrA文库可以在一定程度上替代Archaeal 16S rRNA基因文库来检测瘤胃甲烷菌多样性。两个pArchaeal 16S rRNA基因文库共有序列340个克隆：其中对照组158个,处理组182个。从rRNA进化树上,古菌界(Archaea)分为两大门,泉古菌门(Crenarchaeota)和广古菌门(Euryarchaeota).本研究检测到湖羊瘤胃甲烷古菌都属于广古菌门(Euryarchaeota).甲烷杆菌纲(Methanobacteria).本研究基于97%相似度为临界值,发现对照组湖羊瘤胃Archaeal 16S rRNA基因文库可划分为17个OTU,包括4个优势菌群(成员大于10个),第一个优势菌群属于Methanobrevibacter olleyae,有46个克隆,同源性98%。第二优势菌群属于Mbb. millerae有37个成员,同源性为97%。第三个优势菌群为Mbb. ethanobrevibacter thaueri,有26个克隆,同源性为97%。第四优势菌群为Mbb. millerae,有24个成员,同源性97%。处理组则可分为6个OTU,共有2个优势菌群。第一优势菌群Mbb. millerae,有124个成员,相似性为98%。第二优势菌群为Mbb. Olleyae,有51个克隆,相似性为98%。所以添加延胡索酸钠降低了甲烷菌菌群的数量,由17个减少为6个。其中一个优势菌群变得更加优势,成员显著增加。Mbb. olleyae和Mbb. Millerae是湖羊瘤胃优势产甲烷菌。延胡索酸钠盐的添加在“种”的水平上改变了瘤胃甲烷菌群的结构,菌群多样性降低,但优势菌群变得更加集中,Mbb.Millerae数量显著增加,发挥主要功能。第四部分延胡索酸钠添加对其还原酶frdA基因文库多样性的影响本研究通过不同调控方式探讨延胡索酸钠对其其还原酶frdA基因文库多样性的影响。首先对上述动物试验对照组和处理组分别构建Proteobacteria (变形菌门)延胡索酸还原酶基因fumarate reductase(frdA)克隆文库,进行frdA基因多样性分析,共得到118个核苷酸序列,其中动物对照组60个,处理组58个。经mothur分析后,发现在unique水平动物试验不添加延胡索酸钠组共有37个OTU,处理组共有38个OTU。发现湖羊瘤胃中的fumarate-reducing Proteobacteria主要有以下五大菌簇(clusters):ClusterⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和V,分别属于Proteus mirabilis, Vibrio furnissii, Shewanella sp.,Photobacterium sp.,和Mitsuokella multacida Sdh.添加延胡索酸二钠组的菌群结构较对照组发生显著变化,对照组奇异变形菌(Proteus mirabilis)占主导地位,添加延胡索酸二钠后弗尼斯弧菌(Vibrio furnissii)占主导地位。本研究中所有frdA序列在进化树中都与gammaproteobacteria在同一个分支,说明所有序列都属于gammaproteobacteria.富集试验中采用不同电子供体(甲酸或氢),以延胡索酸二钠为电子受体,进行fumarate reducing Proteobacteria富集培养,发现Proteus mirabilis是与动物试验文库中共享的一个OTU(菌簇)。不同电子供体能显著影响富集物中fumarate reducing Proteobacteria菌群结构的变化。氢和甲酸为电子供体时,frdA文库以Escherichia coli为主要优势菌群；氢为电子供体时,frdA文库以Proteus mirabilis为主要优势菌群,而且此菌群和动物试验frdA文库是共享菌群。富集培养试验frdA文库序列与已知菌相似性高,揭示出富集试验趋向于得到相对较容易培养出来(relatively easy-to-culture)的菌种。还发现体内富集文库与已报道的牛瘤胃Bovine-rumen cluster的分支进化距离很近,而只检测到体外富集试验添加氢为电子供体文库中的一个克隆(EH-OTU3)属于Hu-sheep rumen cluster,其他所有的体外富集文库与动物文库进化距离较远,从进化树的角度反映了体内和体外富集延胡索酸还原菌的差异。体内试验发现湖羊瘤胃中发现大量Vibrio-related species。正常瘤胃条件下(0周),发挥功能的主要fumarate-reducing Proteobacteria菌群属于proteus mirabilis.而添加延胡索酸6周后,主要功能菌群变为Vibrio furnissii, Vibrio furnissii的优势程度从0周的18%增加到6周的50%。还发现6周时出现了一个新的菌种：Shewanella sp.。然而Proteus mirabilis的优势程度从0周的67%降到6周的31%。与Pasteurella multocida相似的克隆占文库多样性的比例从0周的15%降为6周的9%。综上所述,添加延胡索酸二钠有利于瘤胃发酵,从整体上提高瘤胃总菌菌群多样性,降低甲烷菌群多样性,并在“种”的水平上改变了瘤胃甲烷菌菌群结构。添加延胡索酸二钠能提高延胡索酸还原菌的菌群多样性。