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双歧杆菌(Bifidobacterium)是人和动物肠道内重要的生理性细菌之一,它在肠道菌群中所占比例直接影响宿主的健康状况。优良双歧杆菌资源的开发和利用已成为我国乃至世界范围微生态领域研究的热点。本论文以双歧杆菌为研究对象,筛选出具有抗菌活性、抗逆性和安全性的一株益生双歧杆菌,并优化该菌的发酵参数。
1.在14~28日龄时,无菌采集肠道内容物,采用传统微生物培养法,对肉仔鸡肠道双歧杆菌进行分离、培养、鉴定和计数。经生理生化鉴定初步分离到90株双歧杆菌,其中23株生长较快。
2.采用牛津杯法,测定90株双歧杆菌对大肠杆菌和沙门氏菌的抑制作用,筛选出三株生长较快,具有良好抑菌效果的双歧杆菌B<,1>、B<,2>和B<,3>。
3.双歧杆菌要发挥作用,就必须能耐受消化道逆环境。本试验以B<,1>、B<,2>和B<,3>菌株为出发菌株,采用改良MRS培养基,模拟鸡胃肠道逆环境,对其耐消化道特性进行研究。研究结果表明,B<,2>菌株耐受消化道逆环境的能力最好,可用作微生态制剂菌株。同时,B<,2>菌株的生长速度较快,因此最终选定B<,2>菌株进行之后的试验,经初步鉴定双歧杆菌B<,2>为小鸡双歧杆菌,定名为Bifidobacterium.pullorum B<,2>。
4.采用改良MRS培养基研究双歧杆菌B<,2>的生长和代谢规律,发酵18h细菌总数可以从8.3×10<5> CFU/mL 升高到1.3×10<9>CFU/mL,之后有一定的下降。
5.运用单因素试验方法,研究了培养基成分(碳源和氮源)、浓度、基质比例和培养条件等因素对试验菌株Bifidobacterium.pullorum B<,2>生长的影响,并通过三个正交试验研究其营养和非营养参数的最优组合。结果表明,最佳非营养因子参数组合是pH=8、接种量15%和装液量200mL/250mL;菌株培养条件组合:碳源浓度25 g/L,C/N=5:1,接种量15%可使培养液中活菌数达9.8×10<8>CFU/mL;培养基成分为:大豆蛋白胨3.5g,胰胨3g,酵母浸粉7.5g,肽粉6g,葡萄糖10g,蒸馏水1000mL,培养24h,试验菌株活菌数可达8.5×10<9>CFU/mL,.
6.运用优化的发酵培养基:大豆蛋白胨3.5g,胰胨3g,酵母浸粉7.5g,肽粉6g,葡萄糖10g,促生长物质微量,蒸馏水1000mL,接种量15%,在30L反应器中发酵20h,试验菌株活菌数可达1.41×10<10>UCU/mL。