论文部分内容阅读
目的：分离培养人羊膜上皮细胞(human amnion epithelial cells,hAECs)和人羊膜间充质干细胞(human amnion mesenchymal stem cells,hAMSCs)并鉴定其生物学特性，探讨hAECs在高氧所致新生大鼠肺损伤中的作用。实验方法：1.细胞分离及鉴定：收集符合选入标准的足月剖宫产胎盘上的羊膜组织，采用低速多次胰蛋白酶-胶原酶消化法，分别分离获取hAECs及hAMSCs。观察两种细胞形态，通过绘制生长曲线了解增殖情况；采用间接免疫荧光染色检测角蛋白19（cytokeratin19,CK19）及波形蛋白；流式细胞仪分析术检测细胞表面抗原CD29、CD73、CD44、CD166、CD90、CD105、CD49e等；逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR）检测多能干细胞标志八聚体结合转录因子(octamer-binding transcription factor4,Oct-4)、Nanog；油红O染色及茜素红染色法分别检测成脂及成骨诱导分化潜能，对两种细胞生物学特性进行鉴定。2. hAECs对高氧所致肺损伤的作用：8窝（8-12只/窝）出生24h内无特定病原体(SPF)级新生SD大鼠，随机分为正常组、高氧组、高氧+PBS组、高氧+hAECs组。正常组新生大鼠在空气中常规饲养12天；高氧组、高氧+PBS组、高氧+hAECs组新生大鼠生后24h内放入氧浓度90%的环境中持续高氧，常规饲养。高氧第8天，高氧+hAECs组新生大鼠从气管内注入CM-Dil荧光标记的第3代hAECs5×105个，体积40μL；高氧+PBS组新生大鼠从气管内注入PBS液，体积40μL；正常组、高氧组不予任何处理。第10天停止高氧，高氧组、高氧+PBS组、高氧+hAECs组新生大鼠放入空气中继续常规饲养2天。第12天，分别采集各组新生大鼠血液及肺组织标本进行检测。用荧光显微镜追踪被标记的hAECs；肺组织切片HE染色，观察对比各组肺组织病理形态学差异，进行肺损伤评分；检测各组血清及肺组织中炎性因子白细胞介素6（interleukin-6,IL-6）、白细胞介素10（interleukin-10,IL-10）含量，氧化应激反应指标超氧化物歧化酶（superoxidedismutase,SOD）活性、丙二醛（malondialdehyde,MDA）含量及肺组织中髓过氧化物酶（myeloperoxidase,MPO）活性。结果:1.hAECs和hAMSCs生物学特性1.1hAECs为圆形或椭圆形，呈铺路石样生长，最多传至第5代，hAMSCs为成纤维细胞样的长梭形，呈放射状或漩涡状分布生长，可传至30代左右。1.2hAECs表达上皮细胞标志CK19，间有波形蛋白表达，hAMSCs表达波形蛋白，不表达CK19；两种细胞均表达CD29、CD73、CD44、CD166、CD90及OCT-4、Nanog等标志， hAECs不表达CD49e、CD105。1.3细胞成脂油红O染色可见红色脂滴，成骨茜素红染色可见红色钙化结节。2. hAECs对高氧所致肺损伤的作用2.1高氧+hAECs组新生大鼠肺组织中有少量细胞定植，肺泡间隔厚度减低，辐射状肺泡数增多，使肺部急性病理改变得到部分改善。2.2高氧+hAECs组新生大鼠中促炎因子IL-6水平较高氧组明显下降，与高氧+PBS组差异无意义；肺组织中IL-10水平各组差异较大；血清中IL-10水平高氧组明显高于正常组，余各组之间无差异。2.3高氧+hAECs组肺组织中SOD、MPO活性增高及MDA浓度降低均较高氧+PBS组明显，两组差异有意义；血清中高氧+hAECs组与高氧组相比SOD活性增高及MDA浓度降低明显，与高氧+PBS组差异无意义。结论：1. hAECs和hAMSCs均具有干细胞特性；2. hAECs可部分改善高氧引起的新生大鼠肺损伤；3.新生大鼠肺损伤中氧化应激反应可能起主导作用，hAECs调节氧化应激反应作用明显，减轻氧化应激反应可能成为防治高氧肺损伤进而减少BPD发生的有效途径。