研究背景： 肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是目前发病率高、治疗网难、死亡率高的恶性肿瘤，全球每年约有598,000人死于肝癌。我国肝癌的死亡率在所有恶性肿瘤中居第二位，年死于肝癌的人数占全世界肝癌年死亡总数的53％。虽然肝癌的诊断和治疗有了长足的进步，但生存率在总体水平上变化不是很明显。因此对肝癌发病机制的深入研究对肝癌的发生、发展、转移，乃至诊断、治疗、预后均具有重要的意义。 肝癌发生的表遗传学机制研究近些年来受到研究者的高度关注。表遗传学机制主要包括DNA甲基化(methylation)和组蛋白去乙酰化(Histone Deacetylation)。现己确切证明基因肩动子异常甲基化与肿瘤的发生关系密切，基因肩动子区CpG岛甲基化可影响转录因子与其识别序列结合，抑制基因转录，使抑癌基因沉默，因此启动子CpG岛甲基化是除基因突变和染色体物质丢失(LOH或等位基因丢失)外，抑癌基因失表达的第三种机制，而且在某些情况下是抑癌基因失表达的唯一机制。 Wnt通路是一条对胚胎发育起重要调节作用的信号传导通路，而它的异常活化参与多种癌症的发生与发展，大约有33％～67％肝癌中发现有异常活化的wnt信号。该信号通路的组成成员丰要包括：细胞外因子(Wnt)、跨膜受体(frizzled)、胞质蛋白(B-catenin)及核内转录因子(TCF)等一系列蛋白。当细胞外因子与受体结合后，通过一系列胞质蛋白的相互作用使β-catenin蛋白在胞质内累积进而入核与转录因子FCF。共同作用激活靶基因的转录。WIF-1(Wnt inhibitory factor-1)序列高度保守，首先在人的视网膜中被证实，定位于人的染色12q14(4)。WIF-1为保守型分泌型蛋白，和sFR-P家族共同属于第一类Wnt抑制物。WIF-1与Wnt蛋白结合，阻止了wnt与受体的结合，使Wnt的经典及非经典途径均受到抑制，近年来研究证明在非小细胞肺癌、消化系统恶性肿瘤、膀胱癌、鼻咽癌、乳腺癌等恶性肿瘤中存在编码WIF-1的基因肩动子高甲基化，导致转录后WIF-1基因沉默，使WIF-1表达缺失或下调，最终导致Wnt信号通路异常激活并引起相应肿瘤。因此，本研究主要是检测肝癌中WIF-1基因的甲基化状态及表达情况，探讨WIF-1肩动子甲基化对WIF-1表达的影响及其与肝癌临床病理的关系，分析WIF-1甲基化和表达可否作为判断肝癌患者的预后判断的分子标志物；同时通过研究肝癌细胞系中WIF-1启动子高甲基化与表达的关系，并应用去甲基化作用逆转WIF-l基因沉默，恢复WIF-1的表达，以探索其肿瘤治疗潜在靶点的可能及价值。 研究目的： 1、研究肝细胞癌中WIF-1基因甲基化状态及其与表达的关系。 2、探讨肝癌患者WIF-1基因甲基化状态和表达的临床意义。 材料和方法： 5株肝癌细胞系(HepG2、Bel7402、SMMC-7721、Chang Liver、PLC/PFPU5)和1株正常肝细胞系(LO2)，购自上海细胞研究所。细胞系培养及5-aza-dc(5-aza-2-deoxycytidine)处理：肝癌细胞系(高甲基化)在PRMI-1640含10％小牛血清(GIBCO公司)的培养基中连续传代培养。细胞系在终浓度为2uM的5-aza-dc的培养基中连续培养5天，每24小时换一次培养基和5-aza-dc，5天后提取细胞基因组DNA和RNA，检测细胞系的甲基化状态和表达情况，实验中同时设立无5-aza-dc的对照组。 收集2003年1月～2006年4月中山大学肿瘤医院肝胆外科本组连续手术切除的肝癌组织及相应的癌旁组织113例，所有标本均经病理检查确认为肝细胞癌，所选标本中共87例标本可抽提出RNA，手术前未经过放射治疗和化学治疗。入选病例临床资料、术后病理及随访资料完整，所有患者随访至2008年3月，无失访病例。 RT-PCR(Reverse Transcriptase-PCR)检测WIF-1基因mRNA在肝癌细胞系、正常肝细胞系和肝细胞癌及其癌旁组织中的表达。甲基化特异性PCR(Methylation-Specific PCR，MSP)方法检N5株肝癌细胞系(HepG2、Bel7402、SMMC-7721、Chang Liver、PLC/PFRJ5)和1株正常肝细胞系(LO2)的甲基化情况，并检测113例肝细胞癌和癌旁组织中WIF-1基因的甲基化情况；分析实验标本对应患者的临床资料，包括患者性别、年龄、HbsAg、术前Child-Pugh分级、肿瘤大小、肿瘤数目、有无痛栓、有无输血、术后TNM分期、是否根治性切除，术后无瘤生存率及累积生存率，分析肝癌组织中WIF-1基因甲基化和表达与各临床病理因素和预后的关系。 结果： 1.WIF-1基因在4(80％)株肝癌细胞系(HepG2、Bel7402、SMMC-7721和Chang Liver)中均发生部分或完全甲基化，而在肝癌细胞系(PLC/PFRJ5)和正常肝细胞系(LO2)中未发生甲基化。RT-PCR检测，WIF-1基因在发生了甲基化的4(80％)株肝癌细胞系中均无表达，而在未发生甲基化的肝癌细胞系和正常肝细胞系中WIF-1基因高表达。用5-aza-de处理后RT-PCR检测发现2(2/4)株细胞系HepG2和Chang Liver中WIF-1基因重新表达。 2.MSP方法检测113例肝癌中WIF-1基因甲基化率为68.1％(77/113)，癌旁组织为45.1％(51/113)，两组之间的甲基化率差异有显著性(P=0.000，PearsonChi-Square)。RT-PCR检测87例(26例标木不能提取RNA)肝癌中WIF-1 mRNA的表达，阳性率为22.9％(20/87)，而癌旁组织为37.9％(33/87)，两组之间表达差异有显著性(P=0.032，Pearson Chi-Square)。在肝癌组织中，甲基化阳性组的失表达率为85.9％(49/57)，而甲基化阴性组的失表达率60.0％(18/30)，低于甲基化阳性组(R=0.293，P=0.007)。 3.在本研究中，肝癌组织中WIF-1基因甲基化状况和表达水平与患者的临床病理因素之间无明显相关性，生存分析显示WIF-1基因有无甲基化与患者预后无关，而肝癌组织中WIF-1 mRNA表达水平为影响患者累积生存时间的独立危险因素(P=0.049，Cox Regression)。 结论： 1.WIF-1基因在肝癌中发生高频甲基化，并且与其失表达相关。提示该基因异常甲基化可以促进肝癌的发生。 2.WIF-1基因甲基化率低于其RNA的失表达率，表明导致该基因失表达因素除甲基化外可能还存在其他因素。 3.肝癌中WIF-1基因甲基化情况和表达水平与患者临床病理因素不相关，并且WIF-1基因甲基化不影响患者预后。肝癌中WIF-1基因mRNA表达影响患者预后，WIF-1基因表达可能是肝癌预后的一个良性预测因素。