研究背景: 肝细胞癌(hepatocellular careinoma，HCC) 是最常见的恶性肿瘤之一，其恶性程度高、预后较差，发病率及死亡率都很高，自20世纪90年代以来，肝癌的年病死率已上升为城市和农村恶性肿瘤病死率的第二位和第一位。肝癌对放化疗均不敏感，目前手术切除仍是肝癌治疗的最佳选择，但即使是根治性切除，5年内的转移复发率仍然很高，严重影响肝癌病人的术后生存率。因此对肝癌发病机制的深入研究为肝癌的发生、发展、转移，乃至诊断、治疗、预后均具有重要的意义。 肝癌的癌变是一个多基因，多阶段的复杂过程，其分子水平的发病机理还不是十分清楚，目前的流行病学和病因学研究普遍认为肝癌的发病与乙型肝炎病毒(HBV)的感染、黄曲霉毒素及环境理化因素有关。肝癌发生的遗传学和表遗传学机制研究近些年来受到研究者的高度关注。 遗传学机制主要包括DNA甲基化(methylation)和组蛋白去乙酰化(Histone Deacetylation)。现已确切证明基因启动子异常甲基化与肿瘤的发生关系密切，基因启动子区CpG岛甲基化可影响转录因子与其识别序列结合，抑制基因转录，使抑癌基因沉默，因此启动子CpG岛甲基化是除基因突变和染色体物质丢失(LOH或等位基因丢失)外，抑癌基因失表达的第三种机制，而且在某些情况下是抑癌基因失表达的唯一机制。 遗传学研究主要包括染色体畸变、癌基因的激活、抑癌基因的失活，基因杂合性缺失(loss of heterozygosity，LOH)和微卫星不稳定性(microsatellite instability，MSI)等；肿瘤细胞中的等位基因经常发生LOH，在目前已知的人类绝大多数肿瘤细胞染色体上，都发现了LOH现象。LOH的发生是肿瘤细胞基因组不稳定的表现，LOH区域内肿瘤抑制基因的功能丧失和癌基因的激活一样是肿瘤细胞获得无限制性生长的关键。一些甲基化沉默的抑癌基因如P16、P14、E-cadherin和RUNX3等在部分肝癌中亦可因等位基因的杂合或纯合丢失而灭活。 前面研究发现OPCML(Opioid-binding cell adhesion molecule，OPCML)基因在肝癌中发生异常高甲基化，但其作用机制没有进一步研究。OPCML最先由Cho等于1986年从牛大脑提纯出来，定位于人类染色体11q25，表达的蛋白位于细胞膜，是IgLON免疫球蛋白超家族中的一员；OPCML主要分布于大脑皮质，其功能主要是参与细胞之间的粘附、识别及信号传导。目前该基因在卵巢癌中研究较多，主要以启动子区CpG岛异常甲基化和杂合性丢失的方式失活，推测该基因为卵巢癌候选的抑癌基因，其表达失活是恶性肿瘤发生发展的重要因素。目前OPCML基因在肝癌及其他肿瘤中的作用机制罕见研究报道。 近年来人们对外周血循环DNA的各种变化进行了多方面的深入研究，许多学者通过肿瘤病人血清DNA检测到肿瘤特征性的基因改变，如癌基因K-ras、抑癌基因P53的突变，P16、hMLH1、VHL的甲基化及微小卫星不稳定性。研究表明基因启动子异常甲基化是一个高灵敏度的肿瘤生物标志物，启动子区域的过甲基化作为一个信号的增益并非信号的丢失被检测，这个特征使以甲基化为基础的实验比检测基因表达缺失的技术(如微卫星体不稳定或杂合性丢失)更敏感；研究表明血清异常甲基化总是与肿瘤组织甲基化同时出现，血清的检测方法方便，有可能在临床上推广应用。肝细胞癌多通过血行转移，而研究表明循环肿瘤细胞DNA的存在在临床转移和复发症状出现之前已经持续了很久一段时间，因而检测肝癌患者外周血血清中肿瘤相关基因的甲基化状态将为肿瘤的早期诊断、疗效观察及预后判断提供非常有价值的信息。 研究目的: 1．探讨肝细胞癌中OPCML基因失表达的遗传学和表遗传学机制。 2．检测肝癌血清DNA中OPCML基因甲基化情况，寻找肝癌患者血清DNA特异性分子生物学标记物。 材料: 1．收集2003年1月-2004年12月中山大学肿瘤医院肝胆外科手术切除的肝癌组织、相应的癌旁组织48例及相应的术前血清标本44例(另外4例血清标本缺失)，同时随机抽取30例健康者血清标本作对照，所有标本均经病理检查确认为肝细胞癌，所选标本均为未合并癌栓的病例，手术前未经过放射治疗和化学治疗。入选病例临床资料、术后病理及随访资料完整，所有患者随访至2006年11月，无失访病例。 2．肝癌细胞系HepG2和Bel7402购自上海细胞研究所。 方法: 1．实时定量RT-PCR(Real-Time Quantitative RT-PCR)及RT-PCR方法检测OPCML mRNA在肝癌细胞系(HepG2和Bel7402)和肝细胞癌及其癌旁组织中的表达。 2．甲基化特异性PCR(Methylation-Specific PCR，MSP)方法： a．检测肝癌细胞系HepG2和Bel7402甲基化情况： b．检测48例肝细胞癌和癌旁组织中OPCML基因的甲基化情况； c．检测44例肝癌患者及30例健康人血清DNA的甲基化情况； 3．细胞系培养及5-aza-dc(5-aza-2-deoxycytidine)处理：肝癌细胞系HepG2和Bel7402在PRMI-1640含10﹪小牛血清(GIBCO公司)的培养基中连续传代培养。细胞系在终浓度为2uM的5-aza-dc的培养基中连续培养5天，每24小时换一次培养基和5-aza-dc，5天后提取细胞基因组DNA和RNA，实验中同时设立无5-aza-dc的对照组。 4．用PCR-单链构象多态性(PCR-SSCP)法对48例肝细胞癌及其癌旁组织中OPCML基因三个多态性位点D11S4085、D11S1309、D11S874进行LOH分析。 结果: 1．MSP方法检测48例肝癌中OPCML基因甲基化率为77.1﹪(37/48)，癌旁组织为58.3﹪(28/48)，两组之间的甲基化率差异无显著性(P>0.05)这和我们以前的报道基本一致。MSP方法检测发现OPCML基因在HepG2和Bel7402中均发生完全甲基化，用5-aza-de处理后两种细胞甲基化程度发生改变，仅发生部分甲基化，而对照组无明显变化。 2．RT-PCR检测38例(10例标本不能提取RNA)肝癌中OPCML mRNA的表达，阳性率为55.3﹪(21/38)，而癌旁组织为71.1﹪(27/38)，两组之间表达差异无显著性(P>0.05)；RT-PCR及实时定量RT-PCR检测OPCML基因在肝癌细胞系HepG2和Bel7402中均无表达；用5-aza-dc处理后RT-PCR检测仍然未发现OPCML基因表达；但实时定量RT-PCR检测发现OPCML表达水平较5-aza-dc处理前升高，而对照组无变化。 3．MSP方法检测44例(另外4例血清标本缺失)肝癌血清中OPCML基因甲基化率为79.5﹪(35/44)，而30例健康者血清的甲基化率为36.7﹪(11/30)，两组比较有显著性差异(P<0.01)。 4．PCR-单链构象多态性(PCR-SSCP)检测OPCML基因三个多态性位点D11S4085、D11S1309、D11S874均未发现杂合性缺失。 结论: 1．OPCML基因在肝癌中发生高频甲基化，亦是导致其失表达的重要机制之一，且失表达在肝癌的发生发展中可能起重要作用。 2．肝癌中OPCML基因的三个多态性位点D11S4085、D11S1309、D11S874不存在杂合性缺失。 3．OPCML基因启动子异常甲基化在肝癌发生中是一个非常频繁的事件，检测血清DNA中OPCML基因甲基化可作为肝癌早期诊断和监测复发转移的分子生物学标记物。