论文部分内容阅读
研究背景:前列腺癌（Prostate cancer,PCa）是男性泌尿系统中最常见的恶性肿瘤之一。Gleason评分（Gleason Score,GS）是评价PCa侵袭性的“金标准”。近年来关于鉴别侵袭性和非侵袭性PCa标志物的研究已经成为热点。前列腺特异性抗原（Prostate specific antigen,PSA）是PCa早期诊断最常用的标志物,但是PSA在鉴别侵袭性和非侵袭性PCa中的作用还没有被完全证实。岩藻糖基化蛋白在肿瘤的发生发展中有重要的作用。凝集素是目前被广泛应用于富集岩藻糖基化蛋白的一种蛋白质。目的:1.检测PSA在PCa细胞、血清、尿液中的含量。比较PSA在侵袭性和非侵袭性PCa患者中的水平。2.建立基于凝集素富集的免疫检测方法测定岩藻糖基化PSA水平,并对所建方法进行性能评价。3.应用基于凝集素富集的免疫检测方法测定侵袭性和非侵袭性PCa样本中岩藻糖基化PSA的水平。探索岩藻糖基化PSA在鉴别侵袭性和非侵袭性PCa中的作用。方法:1.通过转染α-1,6-岩藻糖转移酶（α-1,6-fucosyltransferase,FUT8）基因,进行侵袭性和非侵袭性PCa细胞模型的建立,并对模型进行评价。将FUT8基因转染到PCa细胞系的LNCap细胞中,构建LNCap FUT8细胞模型,未转染FUT8基因的LNCap细胞为LNCap COT细胞模型,分别代表侵袭性和非侵袭性PCa细胞。使用Western blot检测并比较LNCap FUT8和LNCap COT细胞中FUT8基因的表达和PSA的水平,比较有无差异。进一步采用化学发光法定量检测两组细胞和培养基中PSA的水平,比较有无差异。2.收集PCa患者的血清和尿液标本,检测其PSA的水平。收集 PCa 患者的血清 24 例,其中 33.3%（n=8）为 Gleason 6,33.3%（n=8）为 Gleason 7,12.5%（n=3）为Gleason 8,20.8%（n=5）为Gleason 9。采用化学发光法定量检测不同Gleason评分组血清中PSA的水平。收集PCa患者的中段晨尿标本146例,其中47.9%（n=70）为 Gleason 6,19.2%（n=28）为 Gleason 8,28.1%（n=41）为 Gleason 9,4.8%（n=7）为Gleason 10。采用化学发光法定量检测各个Gleason评分组尿液中PSA的水平。3.建立基于凝集素扁豆凝集素（Lens culinaris agglutinin,LCA）、橙黄网胞盘菌凝集素（Aleuria aurantia lectin,AAL）富集的化学发光方法检测岩藻糖基化蛋白。首先使用琼脂糖凝胶偶联的凝集素富集岩藻糖基化PSA,然后应用化学发光法检测富集的岩藻糖基化PSA的水平,并进一步对所建方法进行性能评价。4.分析岩藻糖基化PSA在鉴别侵袭性和非侵袭性PCa中的临床应用价值。使用琼脂糖凝胶偶联的凝集素富集岩藻糖基化PSA,检测并比较其在侵袭性和非侵袭性PCa标本中的水平。结果:1.FUT8基因在LNCap FUT8细胞系中的表达明显高于LNCap COT细胞系,侵袭性和非侵袭性PCa细胞模型构建成功。与LNCap COT细胞和培养基相比,LNCap FUT8细胞和培养基中PSA的水平明显降低。2.PCa患者血清中,Gleason 8和Gleason 9组中PSA水平相比于Gleason 6组显著升高。然而,血清PSA水平在Gleason 7 组与 Gleason 6 组之间以及 Gleason 7 组与 Gleason 8、Gleason 9 组之间并没有发现明显统计学差异。但是,PSA在Gleason（4+3）+Gleason 8+Gleason 9组中的水平高于Gleason（3+4）+Gleason 6组中的水平。受试者工作特征（Receiver operating characteristics,ROC）曲线下面积为 0.881,p=0.002,有统计学意义。3.PCa患者尿液中,Gleason 6组的PSA水平明显高于Gleason 8、Gleason 9和Gleason 10组。ROC曲线下面积为0.739,p=0.002,有统计学意义。4.在总PSA水平为0-80ng/mL的范围内,LCA、AAL富集岩藻糖基化PSA的水平与总PSA呈线性关系（Y=0.2105X+0.0910,R2=0.9985;Y=0.0543X-0.0182,R2=0.9973）。LCA 和 AAL 富集岩藻糖基化PSA的比率（凝集素LCA富集后的岩藻糖基化PSA浓度/总PSA浓度）分别是21.05%、5.43%。LCA富集岩藻糖基化PSA联合化学发光法检测低值、中值、高值PSA的批内、批间CV<10%,偏倚<10%。AAL富集岩藻糖基化PSA联合化学发光法检测的批内、批间CV<11%,偏倚<11%。所建方法的回收率为80%-110%,与前列腺酸性磷酸酶（Prostatic acid phosphatase,PAP）无明显交叉反应。5.经过AAL富集后,非侵袭性PCa细胞和培养基中岩藻糖基化PSA百分比（%）明显高于侵袭性PCa细胞和培养基中的水平。经过LCA富集后的的岩藻糖基化PSA在非侵袭性PCa细胞和培养基中的水平高于侵袭性PCa。6.PCa血清标本经过AAL富集后,Gleason 6、Gleason 7、Gleason 8和Gleason 9各组中的岩藻糖基化PSA的水平和岩藻糖基化PSA百分比（%）之间有统计学差异。Gleason（4+3）+Gleason 8+Gleason 9组中血清岩藻糖基化PSA和岩藻糖基化PSA百分比高于Gleason（3+4）+Gleason 6组。而经过LCA富集后,Gleason（4+3）+Gleason 8+Gleason 9组中血清岩藻糖基化PSA的水平相对于Gleason（3+4）+Gleason 6组升高。AAL富集岩藻糖基化PSA、AAL富集岩藻糖基化PSA百分比（%）、LCA富集岩藻糖基化PSA、LCA富集岩藻糖基化PSA百分比（%）在鉴别Gleason（4+3）及以上与Gleason（3+4）+Gleason 6组的AUC分别是0.909、0.822、0.839、0.594。7.PCa 尿液标本经过 AAL 和 LCA 富集后,Gleason 8和Gleason 9组中岩藻糖基化PSA和岩藻糖基化PSA百分比（%）与Gleason 6命Gleason 7 组没有统计学差异。Gleason 6、Gleason 7、Gleason 8 和 Gleason 9 各组中的岩藻糖基化PSA和岩藻糖基化PSA百分比（%）之间也没有统计学差异。结论:1.在本研究中我们成功建立了侵袭性和非侵袭性PCa细胞模型。非侵袭性PCa细胞和尿液中PSA的水平高于侵袭性PCa中PSA的水平。在PCa血清中,侵袭性PCa的PSA水平高于非侵袭性PCa血清中PSA的水平。2.成功建立了基于凝集素富集和化学发光检测岩藻糖基化糖蛋白的方法。3.通过所建方法检测PCa标本发现,AAL富集血清岩藻糖基化PSA、AAL富集血清岩藻糖基化PSA百分比（%）、LCA富集血清岩藻糖基化PSA在鉴定Gleason（4+3）及以上与Gleason 6+Gleason（3+4）的PCa患者中有预测作用。其中,AAL富集血清岩藻糖基化PSA的预测能力最好。