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香蕉穿孔线虫[Radopholus similis(Cobb,1893)Thorne,1949]是一种毁灭性的植物病原线虫,是我国禁止进境的植物检疫性有害生物,也是国际上公认的极为重要的检疫性植物寄生线虫。组织蛋白酶B(Cathepsin B)属于木瓜蛋白酶家族的溶酶体内半胱氨酸蛋白水解酶,在许多寄生虫和昆虫的孵化、生殖发育、入侵寄主、对寄主致病和免疫逃避等生理生化过程中具有非常重要的作用。本文从香蕉穿孔线虫线虫中分离得到Cathepsin B基因的全长,并利用RNA干扰技术研究了该基因的功能,主要研究结果如下:
1.通过克隆香蕉穿孔线虫的Cathepsin B基因(Rs-cb-1)片段,构建dsRNA表达载体最终合成Cathepsin B基因dsRNA,纯化鉴定后利用RNAi技术成功干扰了供试香蕉穿孔线虫。利用RT-PCR方法检测Rs-cb-1沉默效应的结果表明,该线虫经过M9 buffer浸泡后Rs-cb-1的表达正常,而经RNAi处理后该基因的表达受阻,表达量明显降低,且在一定条件下适当延长dsRNA浸泡时间可以提高基因沉默效应;但所有处理香蕉穿孔线虫的Actin基因都表达正常。
2.香蕉穿孔线虫不同处理组繁殖力的测定结果表明,接种未经RNAi的香蕉穿孔线虫的胡萝卜愈伤组织因香蕉穿孔线虫正常大量繁殖而呈褐色水渍状;而经过Rs-cb-1dsRNA浸泡的香蕉穿孔线虫接种培养后,各RNAi处理组的胡萝卜愈伤组织均未出现明显的褐色水渍状;经RNAi处理的香蕉穿孔线虫各处理,其繁殖率无论是12 h、24 h、48 h还是72 h都显著低于未经过RNAi的各处理,RNAi处理时间为48h时,该基因的沉默效率最好,繁殖倍数为54,而未经过RNAi的各处理香蕉穿孔线虫的繁殖率均大于420。
3.Rs-cb-1对香蕉穿孔线虫胚胎发育及孵化的影响结果表明:经Rs-cb-1dsRNA浸泡的香蕉穿孔线虫单胞期卵,大多数不能正常发育,胚胎发育历期比对照组相应延长了6～9d,卵的内含物面积缩小,与卵壳分离而积聚在一起,有些卵的部分位置呈“液泡”状,大多数的卵抑制在囊胚期以前而不能完成胚胎发育,甚至死亡,只有少数的卵可以完成胚胎发育,这些卵虽然可以孵化,但孵化后二龄幼虫的发育明显受抑制,甚至死亡;而对照组的卵均能正常发育,各处理间无显著性差异。RNAi 48h时香蕉穿孔线虫二龄幼虫的孵化率最低,为32.08％,而未经过RNAi处理的各对照组其孵化率均在89％左右。
4.Rs-cb-1对香蕉穿孔线虫胚后发育的影响结果表明:经Rs-cb-1dsRNA浸泡的香蕉穿孔线虫体内结构界限模糊,内含物面积缩小且呈“融解弥散”状,发育不正常,而对照组各处理的香蕉穿孔线虫发育均正常,各处理间无显著性差异;RNAi处理对香蕉穿孔线虫的胚后发育有不同程度的抑制作用,与对照组相比相应推迟了5～7d,但RNAi处理的时间不同,各处理胚后发育的历期也有很大的差异,同时该线虫从二龄幼虫发育到雌成虫的历期差异主要表现在J2(二龄幼虫)和J3阶段,而从J4阶段发育为雌成虫的历期较一致,均为3～3.5d;Rs-cb-1对香蕉穿孔线虫胚后发育的影响还表现在推迟雌成虫初产卵日。
5.Rs-cb-1对香蕉穿孔线虫致病性影响的结果表明:供试香蕉穿孔线虫的9个处理对大蕉和红掌均有致病能力,均能够在寄主植物根组织内完成生活史,但不同处理之间的致病力差异显著;经Rs-cb-1dsRNA浸泡的各处理香蕉穿孔线虫致病力显著下降,当RNAi浸泡48后延长浸泡时间到72h,该处理对香蕉穿孔线虫寄生和致病能力的抑制作用并没有随时间的延长而加强,这说明RNAi处理48h就可以使Rs-cb-1充分沉默,这与上述结果一致。
因此,本研究证实了Rs-cb-1dsRNA浸泡可以明显抑制Rs-cb-1的表达量,从而影响该线虫的繁殖、生长发育过程以及对寄主植物的寄生致病性,而且dsRNA浸泡的时间不同,Rs-cb-1的沉默效率也不同,沉默效率最高的dsRNA浸泡最佳时间是48h。本研究为进一步研究利用Rs-cb-1防治香蕉穿孔线虫和进一步开展植物寄生线虫组织蛋白酶的研究提供了科学依据。