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目的:淀粉样蛋白级联假设学说认为淀粉样前体蛋白(APP)经过特定酶的剪切最终形成的β淀粉样蛋白(Amyloid beta,Aβ)会促进阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease,AD)的形成和发展。阿尔茨海默病患者的脑组织皮质区和海马区神经元细胞外形成的老年斑块和纤维缠结中主要成分就是β淀粉样蛋白形成的不可溶性的淀粉样纤维。此外在AD患者的脑实质微血管壁上也存在大量Aβ聚集形成的纤维性斑块,导致血管出现病理性损害,局部血流动力学发生改变,伴随动脉粥样硬化、高血压、高血脂等,最终使脑血流量减少,海马区神经元发生退行性变性,突触死亡,脑部神经元传导通路故障,最终导致痴呆。目前已知在外周循环中,血小板是β淀粉样蛋白的主要载体,约占外周循环中Aβ淀粉样蛋白总量的95%以上,在外周循环中血小板激活后会粘附到受损的血管壁上,并且在血小板的α颗粒中形成的Aβ淀粉样多肽会随着血小板的激活释放出来,本文通过比较健康对照人群和老年痴呆患者血小板中β多肽的表达形式以及血小板的激活状态,探究血小板在AD患者中枢神经系统淀粉样变纤维斑块形成以及AD发病机制中的作用,为AD淀粉样变形成分子机制提供科学依据。方法:1.遵照严格的临床对于阿尔茨海默病的筛查和诊断标准,筛选天津医科大学总医院神经内科2013年9月至2015年10月阿尔茨海默病患者30例,作为实验组(AD组);此外按照与AD患者年龄、性别相匹配的标准,从天津九华体检中筛选健康体检人群90例,作为健康对照组(HC组)。抽取4ml静脉全血,EDTA-2Na抗凝用于实验研究;此外还有病变的心肌、肾组织来自临床获得的阿尔茨海默病患者。2.将心肌组织制成石蜡切片,分别用刚果红染色(Congo Red,CR)、硫磺素T(Thioflavin-T,ThT)荧光染色、苏丹黑染色以及转甲状腺素蛋白(TTR)抗体的免疫组织化学染色对阿尔茨海默病患者的病变心肌组织进行淀粉样变的检测,通过CR与ThT染色对淀粉样变的特异性比较,寻找淀粉样变特异的检测探针。3.提取病变心肌组织的淀粉样变纤维聚集物,用QCM亲和试验测定淀粉样变纤维聚集物与ThT之间的亲和性和结合特异性,结果证实心肌组织中的淀粉样变纤维聚集物和以和ThT发生特异性结合;通过用Aβ的单克隆抗体WB实验,证实ThT特异性结合的心肌组织中的淀粉样纤维聚集物为Aβ淀粉。从而证实ThT可以检测Aβ样纤维聚集物,并且检测具有很高的特异性。4.抽取AD组和HC组受试者的静脉全血4ml,留取100μl,用于全血的ThT荧光探针染色。其余血液通过密度梯度离心法提取血小板并洗涤之后,用于血小板的ThT染色和血小板蛋膜白的分离提取。5.分别将全血和洗涤后的血小板进行ThT染色,探讨用ThT对血小板β淀粉样纤维/聚集物染色的特异性实验中,血浆的存在是否对ThT识别血小板Aβ纤维/聚集物的特异性存在影响。6.通过ThT荧光强度定量实验,比较AD患者组和HC组血小板上淀粉样变之间的差异,包括观察淀粉样变水平AD组和HC组不同年龄组之间的关系。7.采用WB技术证实血浆中和血小板中存在Aβ淀粉样纤维/聚集物和对组织切片的免疫荧光实验证实血小板在形成初期时就已经有β淀粉样成分以及淀粉样纤维/聚集物。8.检测AD组和HC组ThT特异性实验中阳性血小板个体数占总血小板的百分比,及个体ThT阳性血小板数占总体血小板数量百分比。9.通过对血小板各项物理指数的测定和比较分析,探讨在AD组和HC组之间的血液状态和血小板活性的改变。结果:1.刚果红(CR)染色结合偏振光检测结果显示刚果红能够特异性识别心肌组织的淀粉样变纤维结构,并且将组织切片经过ThT对染色发现淀粉样变阳性部位与CR染色显示的淀粉样变沉积部位重叠,非淀粉样变沉积部位ThT荧光染色阴性,ThT对组织淀粉样变纤维的染色敏感度高于CR染色,以上结果说明ThT对与组织淀粉样变纤维具有高度亲和性,可以用来特异性显示淀粉样变纤维结构。2.淀粉样变染色结合抗Aβ抗体细胞免疫染色,探索血小板Aβ纤维/聚集物ThT特异性染色条件,染色结果不受血浆成分干扰,染色方法简易可行。3.ThT探针与血小板膜上Aβ纤维/聚集物具有亲和反应,可清楚观察血小板上淀粉样变;并且能够特异识别血小板膜上的β-淀粉样变纤维/聚集物结合,提示血小板上存在淀粉样变纤维/聚集物。4.血小板在AD组和HC组中,ThT染色试验均为百分百阳性,并且针对个体而言,在其不同年龄阶段的血小板也均呈阳性结果。5.采用WB技术对血小板膜蛋白的分析证实血浆中和血小板中存在Aβ淀粉样纤维/聚集物,并且在AD组和HC组中,Aβ淀粉样纤维/聚集物的表达形式不同,AD组中Aβ的表达形式为70k D和15k D,而HC组中Aβ淀粉样纤维/聚集物的表达形式为43k D和26k D。6.通过对AD组和HC组的血小板物理指数的比较发现D-二聚体(D-Dim)和血小板比积(PCT)在两组之间有显著差异,AD组大于HC组,说明AD中,患者血液处于高凝状态,血小板处于预激活状态相符合。结论:1.通过ThT染色能够特异识别β-淀粉样变纤维,探索一种特异性检测血细胞淀粉样变的方法,并且实现检测血小板的淀粉样变纤维,该方法可用于检测血细胞淀粉样变。2.首次报道人血小板中存在Aβ淀粉样变纤维,利用淀粉样变荧光探针(ThT)结合WB,测定血小板淀粉样变纤维水平,发现且AD患者血小板中淀粉样变纤维聚集形式与健康对照组存在差异。3.分析淀粉样变纤维阳性血小板形态学特征和两组血小板物理指数,发现血浆D-二聚体(D-Dim)和血小板比积(PCT)在两组之间有显著差异,AD患者血小板淀粉样变纤维可导致血小板形态学异常。