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膀胱癌（bladder cancer,BC）是一种泌尿系统常见的恶性肿瘤,其发病率和病死率居高不下,严重威胁人体健康。近年来,随着科学技术的发展,我们对BC的认识愈加深入,对其致病机制及发生发展有了更深的理解,在治疗方面也取得了较大的进展,但是BC的预后仍不理想,尤其是晚期患者,无法显著改善其生存情况,因此,深入研究BC发生和发展的分子机制,筛选特异性标志物具有十分重要的理论意义和临床价值。长链非编码RNA（long non-coding RNA,LncRNA）是非编码RNA,长度超过200个核苷酸,可影响调节基因的表达。LncRNA缺乏完整的开放阅读框,没有蛋白编码功能。哺乳动物基因组序列中多达4-9%的序列可以产生LncRNA。LncRNA最初被认为是基因组转录的“暗物质”或“噪音”,没有生物学功能。后来的研究表明,LncRNA参与了许多重要的细胞功能,如X染色体沉默、基因组印记、染色质修饰、转录激活或抑制等,可以促进相关信号通路的分子功能改变,改变细胞的生命活动。上皮-间充质转化（epithelial mesenchymal transition,EMT）是上皮来源的恶性细胞由于迁移和侵袭能力增强,向间充质细胞转化的生物学过程。EMT的特征性改变包括上皮细胞极性的丧失、细胞间连接的降解、细胞骨架结构重组引起的细胞形态学改变、上皮基因表达下调伴间充质基因表达上调。这些变化使细胞具有更强的迁移、侵袭和降解细胞外基质的能力。竞争性内源性 RNA（competitive endogenous RNA,ceRNA）是 LncRNA 的一种重要的调控机制。LncRNA通过吸收多种微小RNA（microRNA,miRNA）,调节靶基因的表达水平。目前LncRNA在BC中已有一些研究,但作为ceRNA在BC的发生发展以及与上皮-间充质转化相关的转移侵袭中的作用仍不明确,有待进一步研究。本研究分为三个部分,第一部分通过LncRNA芯片筛选BC和癌旁组织中差异性表达的LncRNA,检测其在BC组织和细胞中的表达水平,并通过体外实验和体内实验明确其在BC中的生物学功能;第二部分通过体外实验及体内实验明确LINC00612/miR-590/PHF-14构成ceRNA网络对BC发生发展的调控作用;第三部分通过体外实验阐明LINC00612/miR-590/PHF-14轴对BC细胞上皮-间充质转化的影响。第一部分 LINC00612对膀胱癌细胞增殖和侵袭能力的影响[目的]明确BC组织与癌旁组织中LncRNA的表达谱,筛选表达差异最显著的LncRNA,并研究其在BC中的生物学功能。[方法]通过LncRNA微阵列分析,分析13个BC组织与8个癌旁非肿瘤组织中LncRNA的表达差异,选取表达差异最显著的LncRNA,并在BC组织及BC细胞株中应用实时定量反转录酶-聚合酶链锁反应（quantitative reverse transcript-ion-polymerase chain reaction,qRT-PCR）及原位杂交（In Situ Hybridization,ISH）实验进行验证。核质分离实验及荧光原位杂交（Fluorescence In Situ Hybridization,FISH）确定其亚细胞定位。CCK8、集落形成及Transwell实验明确体外LINC00612对BC细胞增殖、侵袭能力的影响。裸鼠成瘤实验及生物荧光体外成像技术验证体内LINC00612对BC细胞增殖、侵袭能力的影响。[结果]选择前60个在BC组织与癌旁组织中差异表达显著的LncRNA（Fold Change>1.5,P<0.01）,其中LINC00612差异表达最显著。BC组织中LINC00612的表达水平明显高于癌旁组织,BC细胞中LINC00612的表达水平明显高于膀胱上皮永生细胞。LINC00612主要定位于细胞质中。体外实验显示:在BC细胞中过表达LINC00612,BC细胞增殖及侵袭能力增强;下调LINC00612,BC细胞增殖及侵袭能力下降。上述结果在体内实验中得到了证实。[结论]LINC00612在BC组织和细胞中表达异常上调,并且在BC中作为促癌基因发挥增强细胞增殖与侵袭能力的作用。第二部分 LINC00612/miR-590/PHF-14构成ceRNA网络调控膀胱癌发生发展的研究[目的]鉴定LINC00612调控的下游miRNA及靶基因,阐明LINC00612构成ceRNA网络调控BC发生发展的机制。[方法]通过生物信息学方法筛选LINC00612可能结合的miRNA,RNA免疫共沉淀（RNA immunoprecipitation,RIP）、RNA pull down及双荧光素酶报告基因实验验证LINC00612与目标miRNA的结合关系。调节BC细胞中LINC00612的表达,观察目标miRNA水平的变化。应用生物信息学方法筛选目标miRNA可能调控的下游靶基因,qRT-PCR、RIP和双荧光素酶报告实验验证目标miRNA与靶基因的结合关系。调节BC细胞中目标miRNA的表达,qRT-PCR和western blotting检测靶基因在mRNA和蛋白水平的表达。细胞功能回复实验（挽救实验）和体内实验验证上述结果。[结果]生物信息学方法筛选miR-590是LINC00612下游的目标miRNA,RIP、RNA pull down和双荧光素酶报告实验证明,LINC00612和miR-590可以直接结合。BC细胞中调节LINC00612的表达,miR-590的表达变化呈负性相关。生物信息学方法筛选miR-590下游靶基因,经qRT-PCR、RIP和双荧光素酶报告实验验证,PHF-14是miR-590下游的靶基因。BC细胞中调节miR-590的表达,PHF-14的表达变化呈负性相关。细胞功能回复实验显示LINC00612/miR-590/PHF-14轴可调控BC细胞的增殖及侵袭,该结果在体内实验中也获得了进一步证实。[结论]LINC00612通过海绵样吸附miR-590进一步调控下游靶基因PHF-14的表达,并由此影响BC细胞的增殖及侵袭能力,LINC00612/miR-590/PHF-14构成ceRNA网络调控BC的发生发展。第三部分 LINC00612/miR-590/PHF-14轴调控膀胱癌细胞上皮-间充质转化的研究[目的]研究LINC00612/miR-590/PHF-14轴对BC细胞上皮-间充质转化的调控作用。[方法]通过western blotting及FISH实验检测LINC00612/miR-590/PHF-14轴对E-cadherin、N-cadherin和vimentin表达水平的影响。[结果]LINC00612 下调增强了 E-cadherin 的表达,削弱了 N-cadherin 和 vimentin 的表达,LINC00612过表达抑制了E-cadherin的表达,而N-cadherin和vimentin表达增加,PHF14可以取消LINC00612对E-cadherin和vimentin表达的调控作用。[结论]LINC00612/miR-590/PHF-14轴通过ceRNA机制调控BC细胞上皮-间充质转化。