LPS刺激幼年特发性关节炎相关葡萄膜炎外周血单核细胞转录组测序和细胞因子的研究

来源 :兰州大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:ioljok1988
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目的:通过对细菌脂多糖(LPS)刺激的抗核抗体(ANA)阳性幼年特发性关节炎相关葡萄膜炎(JIAU)、经治疗ANA转阴JIAU、健康者的外周血单核细胞(PBMCs)转录组测序和细胞因子分析,探讨LPS刺激后ANA对其差异基因的表达、功能及关键的生物学信息通路的影响,以及揭示JIAU的发病机制。方法:选择2018年1月到2019年6月期间于首都医科大学附属北京朝阳医院眼科门诊就诊ANA阳性JIAU及经治疗ANA转阴JIAU患者20例,每组各10例患者。ANA阳性组男4例,女6例,年龄216岁(平均8.6岁),ANA阴性组男4例,女6例,年龄716岁(平均11.2岁)。同时选取相同时段内的健康志愿者10例作为对照组,其性别、年龄与实验组相匹配。抽取每组中的5例患者及健康志愿者12ml静脉血并分离PBMCs,将PBMCs分别植入12孔板和24孔板进行LPS刺激培养,抽取每组余5例患者及健康志愿者6ml静脉血并分离PBMCs,将其植入24孔板进行LPS刺激培养,LPS终浓度均为1ug·m L-1。12孔板PBMCs于LPS刺激12小时后提取RNA,用Illumina Hiseq 2500平台对其进行转录组测序,通过基因功能富集(GO)、KEGG信号通路和基因共表达网络等筛选出显著差异表达关键基因。Real-time PCR验证结果。24孔板内的细胞上清液在LPS刺激0h、3h、6h、12h、24h 5个时间点通过酶联免疫吸附测定法检测IL-6、IL-1、TNF-α和IL-10的浓度。采用免疫荧光法观察LPS刺激后巨噬细胞的变形情况。结果:(1)分析LPS刺激PBMCs转录组测序结果显示,与正常对照组相比,经治疗ANA转阴JIAU组有2097个基因表达水平发生显著改变,其中有1822个基因表达上调,275个基因表达下调,GO分析发现重要功能包括细胞对LPS刺激反应,细胞通讯、炎症与免疫反应等,KEGG信号通路主要集中在细胞因子受体相互作用及Toll样受体信号通路等炎症相关通路。通过分析得出8个重要基因,Real-time PCR验证结果与转录组测序结果相符。(2)分析LPS刺激PBMCs转录组测序结果显示,与ANA阴性JIAU组相比,ANA阳性JIAU组共有640个显著差异表达基因,其中包括272个上调基因和368个下调基因。显著富集的上调GO主要表现集中在细胞成分上,显著富集的KEGG通路有6条,包括细胞因子受体相互作用、JAK-STAT信号通路等,其中SOCS1表达显著下调。(3)ELASE检测细胞因子结果:ANA阳性JIAU患者较ANA(-)JIAU及健康对照组在LPS刺激下分泌更高浓度的细胞因子,TNF-α、IL-1β和IL-6在6 h达最高浓度,IL-10在24 h达最高浓度。(4)免疫荧光显示分离的单核细胞呈圆形。LPS刺激6h后,ANA(+)组非圆形细胞/圆细胞比例最高。结论:1.ANA(-)JIAU参与Toll样受体信号通路等多条炎症与免疫相关的信号传导通路,通过筛选获得多个重要基因及抗炎靶点,其中通过下调CLEC10A可能在发挥抗炎作用方面有研究价值;2.ANA(+)JIAU对LPS刺激的敏感性更高,更易产生炎症反应;SOCS1可能在ANA(+)JIAU发病中有重要作用。
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