褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)头肾TCRα+与CD8α+淋巴细胞抗体制备及T淋巴细胞特性分析

来源 :青岛农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:ceshi110
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T淋巴细胞在脊椎动物的细胞免疫及适应性免疫中起重要作用,本文研究的牙鲆(Paralichthys olivaceus)属于硬骨鱼类,主要依靠适应性免疫消灭外界病原体,CD8α和TCRα同属于T淋巴细胞表面的标志分子,其可与MHCⅠ类分子相结合从而识别抗原,消灭外界病原体,在适用性免疫系统中发挥重要作用。  根据已经公布CD8α和TCRα基因序列首次克隆和表达了牙鲆的CD8α和TCRα分子,随后为了更好地探究其头肾淋巴细胞的特性,制备了可特异性识别抗CD8α多克隆抗体(鼠抗)及抗TCRα多克隆抗体(兔抗),并利用共聚焦显微镜,流式细胞术和Western-blot三种方法对2种抗体进行特异性分析。Western-blot结果显示兔抗TCRα多抗可特异性识别头肾淋巴细胞的一个100 kDa的蛋白,鼠抗CD8α多抗可特异性识别头肾淋巴细胞的一个45 kDa的蛋白;荧光双染后发现了TCRα+/CD8α+,TCRα+/CD8α-和TCRα-/CD8α-三种淋巴细胞;流式细胞术表明TCRα+/CD8α+的阳性率为55.1%,TCRα-/CD8α-的阳性率为75.5%,而TCRα+/CD8α-的阳性率为20.4%。  为了进一步研究淋巴细胞的特性,利用流式细胞仪将细胞分为TCRα+,CD8α+,TCRα-,CD8α-四类,并用qPCR分析IFN-γ,MHC-Ⅱα,CD4-1,IgM-H四种免疫分子在四类细胞中的表达情况,结果表明IFN-γ在四类细胞中均有表达,IgM-H只在TCRα-,CD8α-两类细胞群中表达,而相比与TCRα-,CD8α-两类细胞群MHC-Ⅱα在TCRα+,CD8α+两类细胞群中表达量更高,CD4-1则在CD8α-,TCRα+两类细胞群中表达量更高。  此外,头肾白细胞培养过程中加入细胞分裂素伴刀豆球蛋白A,植物血凝素及脂多糖,并在3,5,7天利用流式细胞术检测其阳性率,其中在加入植物血凝素后的第五天细胞CD8α和TCRα的阳性率分别上升到92.4%和98.0%,伴刀豆球蛋白A上升幅度低于植物血凝素,而脂多糖刺激后的阳性率则一直处于下降状态,其结果表明牙鲆TCRα,CD8α分子与哺乳动物TCR,CD8分子具有相似的特性。这项研究将成为有助于开发牙鲆T细胞介导的免疫特性的新工具。
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