由子囊菌黑腐皮壳属真菌Valsa mali（Cytospora sacculus（Schwein.）Gvrit.）导致的苹果树腐烂病（apple Valsa canker）在我国危害严重,每年造成巨大经济损失,是苹果生产中的重点防治对象。解析该病菌致病机制对腐烂病的科学防治有着重要的指导意义,而挖掘关键致病因子是其基础工作之一。近年来,尽管国内外在V.mali的致病机制研究中取得了一系列进展,该病菌与苹果互作过程中的关键致病因子仍有待深入挖掘和解析。研究发现,NIS1蛋白（Necrosis-inducing secreted protein 1）是一类广泛分布于真菌的保守效应分子,在病菌与寄主互作过程中发挥多种作用。因此,为挖掘V.mali中的关键致病因子,本研究从NIS1蛋白切入,对V.mali中NIS1同源蛋白进行了鉴定以及功能分析。主要研究结果与结论如下:（1）VmNIS1和VmNIS2的鉴定为鉴定V.mali中的NIS1同源蛋白,本研究分别以功能解析较为清楚的Co NIS1（黄瓜炭疽病菌Colletotrichum orbiculare中NIS1蛋白）和Mo NIS1（稻瘟病菌Magnaporthe oryzae中NIS1蛋白）为蛋白基础序列,成功鉴定到V.mali中两条序列VM1G＿07228和VM1G＿03758并分别命名为VmNIS1和VmNIS2。保守结构域分析显示,VmNIS1、VmNIS2、Co NIS1和Mo NIS1类似,均没有已知结构域。蛋白序列分析发现,Co NIS1、Mo NIS1、VmNIS1和VmNIS2相似度在20%～45%之间。系统发育分析发现,VmNIS1与Co NIS1的亲缘关系更接近,而VmNIS2与Mo NIS1更接近。（2）VmNIS1是一个免疫激发子,但不是V.mali的致病因子在本氏烟（Nicotiana benthamiana）上瞬时表达VmNIS1发现,VmNIS1能诱导细胞坏死,但不能抑制激发子INF1诱发的细胞坏死。为探究VmNIS1是否激发植物免疫反应,我们首先利用大肠杆菌（Escherichia coli）进行原核表达获得了VmNIS1重组蛋白。用1μM VmNIS1纯化蛋白处理本氏烟后发现,VmNIS1能够在本氏烟中激发强烈的活性氧（ROS）以及本氏烟过敏性坏死（HR）标志基因（Nb HIN1和Nb HSR203J）、水杨酸通路标志基因（Nb PR1a、Nb PR2）和茉莉酸免疫通路标志基因（Nb PR4和Nb LOX）以及PTI标志基因（Nb PTI5、Nb Acre31、Nb WRKY7及Nb CYP71D20）均上调表达,其中Nb PR1a和Nb CYP71D20上调倍数较大,分别为139.1倍和138.8倍;病菌侵染结果显示,VmNIS1处理本氏烟后,辣椒疫霉（Phytophthora capsici）的侵染程度显著下降,病菌的相对生物量下降72.4%。这些结果表明,VmNIS1是一个激发子,能够被本氏烟识别并激发免疫反应。为探究VmNIS1对V.mali致病力的影响,本研究利用PEG介导的遗传转化体系得到VmNIS1的缺失突变体ΔVmNIS1-50。接种苹果树枝条发现,ΔVmNIS1-50侵染程度与野生型相比无明显变化,表明VmNIS1不是V.mali的重要致病因子。（3）VmNIS2是一个免疫抑制子和V.mali的重要毒性因子在本氏烟进行瞬时表达发现,VmNIS2不能诱导细胞坏死,但是能够抑制INF1诱发的细胞坏死。进一步研究发现,VmNIS2能够显著降低细菌模式分子flg22诱导的活性氧迸发及本氏烟免疫标志基因Nb PR1a和Nb PR4的表达水平,并促进辣椒疫霉在本氏烟上的侵染。其中Nb PR1a和Nb PR4分别下降了63.4%和78.3%,辣椒疫霉相对生物量提高91.0%。以上结果表明VmNIS2是一个免疫抑制子。为探究VmNIS1对V.mali致病力的影响,我们通过PEG介导的遗传转化体系成功得到VmNIS2的缺失突变体△VmNIS2-13和△VmNIS2-87。致病力测定显示,△VmNIS2-13和△VmNIS2-87较野生型分别下降了13.2%和16.9%,基因回补后致病力恢复至与野生型相当水平,表明VmNIS2是V.mali的重要毒性因子。综上,本研究从V.mali中鉴定到两个NIS1-like蛋白VmNIS1和VmNIS2并明确了其基本生物学功能。其中,VmNIS1是一个免疫激发子,能够被植物识别并诱导免疫反应,对病菌致病力无明显影响;VmNIS2是一个免疫抑制子,能够抑制植物免疫反应,是病菌的重要毒性因子。本研究揭示了保守型效应分子NIS1蛋白在V.mali中的基本功能,也为腐烂病菌与苹果的互作研究奠定了重要理论基础。