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缺血性心脏病(ischemic heart disease,IHD)是威胁人类健康最重要疾病之一,且发病率和死亡率较高。血管内皮功能紊乱作为心肌缺血损伤的起始环节,其与IHD的发生发展密切相关。目前,缺血预适应(ischemic preconditioning,IPC)有望成为缓解心肌缺血损伤的方法,研究发现IPC处理的大鼠循环血中的微囊泡(microvesicels,MVs)含量明显增加,且MVs可发挥抗心肌缺血损伤的作用。在整个心血管系统中,不同类型的细胞间交流可以通过MVs进行,而MVs携带的活性物质可以参与到细胞间调控,并且这些MVs大部分来源于内皮细胞,并在IPC发挥抗心肌缺血损伤的过程中有重要的作用。但有关缺氧预适应(Hypoxia preconditioning,HPC)诱导的内皮细胞来源的MVs对心肌细胞的作用尚无报道。本实验通过HPC的方法诱导人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)释放MVs,研究其对正常培养的H9c2心肌细胞的作用和和凋亡相关蛋白表达的影响,为IPC治疗心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)损伤的研究开辟新的方向。目的:本研究在细胞水平采用HUVECs建立HPC模型,并采用HPC的方法诱导HUVECs分泌MVs,探讨HPC-EMVs对于H9c2细胞的作用和心肌Caspase3、Bcl-2和Bax表达的影响。方法:1.HUVECs HPC模型的建立将正常培养的HUVECs接种于96孔板后,于孵箱中培养24 h,分为Control、H/R(hypoxia/reoxygenation)和HPC三组。Control组正常培养,H/R组按照缺氧12 h,复氧4 h的方式处理,HPC组采用不同的预缺氧/复氧条件处理细胞,再进行缺氧12 h,复氧4 h的处理。采用MTT法检测各组细胞存活率,选择适宜的细胞种板密度、预缺氧/复氧时缺氧液的pH值和预缺氧/复氧时间,构建HPC模型。2.HPC诱导HUVECs释放MVs和其定性定量分析HPC处理HUVECs后收集细胞及其上清,两步离心法提取MVs得到HPC-EMVs。采用BCA法对MVs进行蛋白定量测定。取少量MVs用于透射电镜观察MVs的超微结构。3.HPC-EMVs对于正常H9c2细胞的影响H9c2细胞按照1×10~5个/mL密度接种于培养板中,正常培养24 h。将细胞分为Control组、10、30、60μg/mL HPC-EMVs组。Control组加入无FBS的DMEM培养基培养4 h;HPC-EMVs组分别加入DMEM稀释的终浓度为10、30、60μg/mL的HPC-EMVs,孵育4 h。细胞存活率和损伤分别通过MTT法及比色法测定细胞培养液的乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性。H9c2细胞凋亡的形态改变采用Hoechst 33258染色观察。细胞凋亡相关蛋白的检测,采用比色法测定培养液Caspase 3活性以及Western blot法检测H9c2细胞中Bcl-2和Bax的表达。结果:1.成功建立HUVECs的HPC模型HUVECs以6×10~4个/mL的细胞密度种板,HPC组每孔加入pH 6.8的缺氧液后,进行预缺氧10 min/复氧15min的处理,再加入等量pH 5.8的缺氧液,进行缺氧12 h/复氧4 h的处理。与H/R组相比,HPC组存活率显著升高(94.83±2.55%vs 75.98±4.54%,P<0.01),且模型稳定,重复性好。2.HPC诱导HUVECs释放MVs和其定性定量分析HPC成功诱导HUVECs释放MVs,即HPC-EMVs。采用BCA法对MVs进行蛋白测定,其蛋白浓度为0.298±0.045μg/μL。通过透射电子显微镜观察到HPC-EMVs呈圆形或椭圆形膜性囊泡结构,直径在100-1000 nm。3.HPC-EMVs对于正常H9c2细胞的影响与Control组比,HPC-EMVs 30和HPC-EMVs 60μg/mL组细胞存活率明显降低(90.43±1.21%,73.19±2.11%vs 100±0%,P<0.01或P<0.001),并且HPC-EMVs 30和HPC-EMVs 60μg/mL组细胞培养液中LDH活性显著增高(132.97±4.92,157.38±6.94 vs 116.23±6.88,P<0.001),而HPC-EMVs 10组LDH活性有所降低(114.25±6.31 vs 116.23±6.88);Hoechst 33258染色观察到随HPC-EMVs浓度增加,细胞核凝聚,可见细小不规则颗粒状,细胞碎片增多,凋亡细胞数目增加;与Control组比较,HPC-EMVs 60μg/mL组Caspase3活性显著升高(307.29±9.25 vs 140.04±10.37,P<0.01)。与HPC-EMVs 10和HPC-EMVs 30μg/mL组相比,HPC-EMVs 60μg/mL组Caspase 3活性显著增高(142.51±10.55,182.78±6.58 vs 307.29±9.25,P<0.001);与Control组比,随HPC-EMVs浓度增加,蛋白Bcl-2/Bax比值逐渐下降。结论:1.本实验成功建立了HUVECs HPC的模型。2.采用缺氧液pH 6.8/5.8和预缺氧10 min/复氧15 min的方法成功诱导HUVECs产生MVs,HPC-EMVs蛋白浓度为0.298±0.045μg/μL。透射电镜观察到MVs为直径大小在100-1000 nm的圆形或椭圆形膜性囊泡结构。3.HPC-EMVs降低正常H9c2细胞存活率,增加LDH漏出,其中60μg/mL HPC-EMVs作用最为显著。HPC-EMVs显著降低Bcl-2/Bax的比值。表明HPC-EMVs促凋亡机制可能为Bcl-2/Bax比值的下调。