论文部分内容阅读
目的:1.研究SDF-1与皮肤鳞状细胞癌之间的关系。2.研究SDF-1与皮肤鳞状细胞癌细胞迁移之间的关系。3.研究塞来昔布通过SDF-1在皮肤鳞状细胞癌细胞迁移的作用机制。方法:1.检测SDF-1在人皮肤鳞状细胞癌皮损组织及正常皮肤组织中的表达水平:收集2017年9月起我院门诊和住院部确诊为皮肤鳞状细胞癌患者的皮损组织及正常皮肤组织,通过免疫组织化学技术检测SDF-1表达水平。2.检测人鳞状细胞癌细胞系A431和SCL1受到UV照射后SDF-1的表达水平:常规培养人鳞状细胞癌细胞系细胞（A431和SCL1）,经不同强度UV照射后（0 m J/cm~2,3 m J/cm~2,5 m J/cm~2,10 m J/cm~2,20 m J/cm~2及30m J/cm~2）,通过免疫印迹（Western Blot）、酶联免疫吸附实验（Elisa）、实时定量荧光PCR（RT-PCR）技术,从蛋白质、RNA水平检测SDF-1蛋白表达水平及转录水平。3.检测SDF-1/CXCR4通路在人鳞状细胞癌细胞迁移作用:以内吞抑制剂MDC/CXCR4拮抗剂AMD3100/CXCR7拮抗剂CCX771预处理人鳞状细胞癌细胞系1小时,再以不同剂量的SDF-1（0ng/m L、10 ng/m L、50 ng/m L、100 ng/m L）处理12小时,通过Transwell实验评估其细胞侵袭迁移能力。再用不同剂量SDF-1（0ng/m L、30 ng/m L、100 ng/m L、300 ng/m L）处理人鳞状细胞癌细胞系,通过流式细胞术观察细胞膜表面CXCR4+细胞数,确定SDF-1是通过与CXCR4受体作用继而诱导人鳞状细胞癌细胞发生迁移。4.检测塞来昔布与SDF-1/CXCR4通路在人鳞状细胞癌细胞迁移关系:以不同剂量塞来昔布（0μM、10μM、25μM、50μM、100μM）处理人鳞状细胞癌细胞系12小时,并用CCK8检测细胞活力。塞来昔布（100μM）预处理人鳞状细胞癌细胞系1小时,再以不同剂量SDF-1（0ng/m L、10 ng/m L、50 ng/m L、100 ng/m L）处理12小时,通过Transwell实验评估皮肤鳞状细胞癌细胞迁移能力。最后流式细胞术观察空白对照组、SDF-1（100 ng/m L）组、塞来昔布（100μM）组、SDF-1（100ng/m L）联合塞来昔布（100μM）组细胞膜表面CXCR4+细胞数,确定塞来昔布通过SDF-1/CXCR4通路抑制人鳞状细胞癌细胞迁移。5.检测塞来昔布与SDF-1/CXCR4介导人鳞状细胞癌细胞迁移的下游信号通路:人鳞状细胞癌细胞系分别经内吞抑制剂MDC、CXCR4抑制剂AMD3100、塞来昔布处理后加入SDF-1,通过免疫印迹（Western Blot）检测细胞中p ERK1/2、p Akt、Akt表达水平。结果:1.皮肤鳞状细胞癌组织中SDF-1表达水平明显上调:与正常皮肤组织对比,皮肤鳞状细胞癌患者皮损组织行SDF-1免疫组织化学染色呈强阳性表达。2.紫外线照射可呈剂量依赖性地上调SDF-1在皮肤鳞状细胞癌细胞中的表达:皮肤鳞状细胞癌细胞系（A431和SCL1）予不同强度UV照射后,Western Blot检测SDF-1蛋白表达水平明显高于空白对照组;ELISA检测SDF-1蛋白表达水平明显高于空白对照组;实时定量荧光PCR检测SDF-1的m RNA转录水平明显高于空白对照组。3.SDF-1通过与CXCR4受体作用促进皮肤鳞状细胞癌细胞迁移:内吞抑制剂MDC、CXCR4拮抗剂AMD3100、CXCR7拮抗剂CCX771预处理人鳞状细胞癌细胞系1小时,再用不同剂量的SDF-1（0ng/m L、10ng/m L、50ng/m L、100ng/m L）处理12小时后,通过Transwell实验评估其细胞迁移能力,发现SDF-1诱导细胞迁移呈剂量依赖性。内吞抑制剂MDC和CXCR4拮抗剂AMD3100可抑制SDF-1诱导的皮肤鳞状细胞癌细胞迁移。另外,用不同剂量SDF-1（0ng/m L、30ng/m L、100ng/m L、300ng/m L）刺激A431细胞,通过流式细胞术观察细胞膜表面CXCR4+细胞数,提示SDF-1是通过与CXCR4受体作用继而诱导人鳞状细胞癌细胞发生迁移,且呈剂量依赖性。4.塞来昔布通过SDF-1/CXCR4通路抑制皮肤鳞状细胞癌细胞迁移:塞来昔布（100μM）预处理人鳞状细胞癌细胞系1小时后,再用不同剂量的SDF-1（0ng/m L、10ng/m L、50ng/m L、100ng/m L）处理12小时,Transwell侵袭实验结果显示塞来昔布可以抑制SDF-1诱导的CSCC细胞迁移。流式细胞仪观察SDF-1（100ng/m L）组和SDF-1（100ng/m L）联合塞来昔布（100μM）组细胞膜上CXCR4的表达情况,结果表明塞来昔布通过SDF-1/CXCR4通路抑制人鳞状细胞癌细胞迁移。5.塞来昔布通过抑制SDF-1/CXCR4通路介导的ERK/Akt细胞信号通路抑制皮肤鳞状细胞癌细胞迁:与移SDF-1组相比,抑制剂组ERK–Akt信号通路中p ERK1/2、p Akt、Akt蛋白表达水平降低。另外,塞来昔布（100μM）联合SDF-1（100ng/m L）共处理24小时,同样可观察ERK/Akt细胞信号通路激活程度下降。结论:1.在皮肤鳞状细胞癌中,紫外线照射可呈剂量依赖性地上调皮肤鳞状细胞癌细胞中的SDF-1表达。2.SDF-1通过与CXCR4受体作用促进CSCC细胞迁移。3.塞来昔布通过SDF-1/CXCR4通路抑制CSCC细胞迁移。ERK-Akt细胞信号通路在塞来昔布抑制SDF-1/CXCR4通路诱导CSCC细胞迁移起关键作用。