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研究目的及背景细胞外基质(extracellular matrix,ECM)中的糖胺聚糖(glycosaminoglycan,GAG)和蛋白聚糖(proteoglycan,PG),因其“潴留”致病因子在内的多种功能,能很好地诠释中医“痰”重浊粘滞等特性,是研究“痰”证致病机理的很好的切入点;尤其是硫酸软骨素(chondroitin sulfate,CS)/硫酸皮肤素(dermatan sulfate,DS)类 P G,作为广泛存在于外基质ECM中的生物大分子,在冠心病中发挥了重要的致病作用。很多文献对病理和生理状态下的主动脉壁进行了 GAG和PG水平的研究。本文也通过G AG为切入点探求冠心病患者痰证和非痰证之间所存在的差异及其可能机制。方法患者来自广东省中医院大学城分院心内血管一科。在整体血样检测方面,分别Elisa法检测冠心病痰证和非痰证患者血清中的转化生长因子(transforming growth factor-beta 1,TGF-β1)含量,q-PCR 法测定白细胞CD44v6表达,western blot验证白细胞CD44表达。提取冠心病痰证和非痰证患者血清和血细胞的GAG,及患者血清作用小鼠主动脉血管平滑肌细胞(mouse aorta vascular smooth muscle cell,MOVAS)培养后上清液的GAG;分别用硫酸苯酚法、硫酸咔唑法、醋酸纤维膜电泳法测定GAG含量。提取氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,oxLDL)造模,中药单体贝母素乙、橙皮苷、桔梗皂苷D,干预细胞培养后上清液的GAG,用硫酸咔唑法测定GAG含量。阿利新蓝染色法测定糖胺聚糖GAG分泌的时间规律;凝集素检测法测定24h、48h糖胺聚糖GAG种类,Western Blot法测定蛋白聚糖PG种类;提取TGF-β 1依赖Smad通路抑制剂SB525334、和PI3K通路抑制剂wortmannin(针对PI3K)、MK2206(针对Akt)干预的血清作用细胞培养后上清液的GAG,用硫酸咔咗法测定GAG含量,western blot验证血小板结合蛋白基序(TSP)的解聚蛋白样金属蛋白酶4(A Disintegrin and Metalloproteinase with Thrombospondin motifs,ADAMTS4)和多能蛋白聚糖(versican)经金属蛋白酶ADAMTS1/4作用的酶解片段。成纤维生长因子-糖胺聚糖-成纤维生长因子受体(basic fibroblast growth factor-glycosaminoglycan-fibroblast growth factor receptor,bFGF-GAG-FGFR)三元复合物法测定MOVAS增殖率,western blot验证磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(Phosphoinositide 3-kinase/serine-threonine kinase,PI3K/Akt)下游核因子(nuclear factor kappaB,NF-κB)和水解酶成纤维细胞激活蛋白(fibroblast activation protein,FAP)表达。结果冠心病痰证和非痰证患者血清中的GAG无统计学差异;与非痰证相比,相近血糖水平的痰证患者血清作用于MOVAS后,上清液中的GAG增高;在oxLDL造模组GAG增高,三种中药单体皆将GAG含量降至接近正常对照组。血清干预细胞培养24h,非痰证组和正常对照组上清液中的GAG含量开始升高,血清干预细胞培养48h,非痰证组和正常对照组上清液中的GAG含量开始回落,痰证组上清液中的GAG含量开始升高并超过非痰证组和正常对照组。增高的GAG主要是软骨素CS,相应的CSPG是多能蛋白聚糖versican和双糖链蛋白聚糖biglycan;与非痰证相比,痰证患者血清中TGF-β 1含量增高;单独TGF-β 1与痰证血清作用于MOVAS的趋势相同。抑制Smad通路和PI3K/Akt通路都能减少GAG的分泌;但在抑制Smad通路后,痰证GAG含量增高的效应仍存在,而在抑制PI3K通路后,痰证GAG增高的效应消除了;金属蛋白酶ADAMTS4和酶解片段的表达在痰证组中升高表明TGF-β1通过下调CSPG的降解酶使得痰证组GAG含量高于非痰证组。与非痰证组相比,痰证组三元复合物、核因子NF-κB p65亚基和成纤维激活蛋白FAP在血清作用的MOVAS升高,表明痰证血清可以诱导MOVAS增殖、外基质ECM重塑和招募炎症反应。在痰证患者血液样本中也检测到白细胞表面抗原CD44和CD44v6的增高。结论冠心病痰证患者血清中升高的TGF-β1,可能通过激活血管平滑肌细胞的SMAD通路和PI3K/Akt通路引起GAG-CSPG类versican和biglycan升高,并通过下调金属蛋白酶等如ADAPMTS4来抑制这些CSPG的降解来引起GAG-PG在动脉壁的蓄积。化痰类中药可逆转oxLDL引起的GAG蓄积。PI3K/Akt是细胞增殖(尤其是肿瘤发生)的重要通路,通过不同的下游信号可引起1、血管平滑肌细胞的增殖2、基质水解酶如成纤维激活蛋白FAP所代表的基质重塑3、核因子NF-kB所招募的炎症反应。4、痰证患者血液中的白细胞CD44(尤其是CD44v6)的升高也证明痰证患者血液中的白细胞通过表面抗原CD44与血管壁外基质中的versican结合浸润到病灶。