【摘 要】
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癌症正严重威胁着人类的健康,如何有效的阻断癌症发生发展是医学领域的重大课题。脯氨酰异构酶Pin1,是致癌信号通路调控中枢“脯氨酸磷酸化事件”的操控者。相关实验证明其特异性抑制剂全反式维甲酸（All-Trans-Retinoic Acid,ATRA）与三氧化二砷（Arsenic Trioxide,ATO）能协同有效地抑制并降解活性Pin1,阻断多个Pin1参与调控的癌症通路,产生显著的肿瘤抑制效果。
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癌症正严重威胁着人类的健康,如何有效的阻断癌症发生发展是医学领域的重大课题。脯氨酰异构酶Pin1,是致癌信号通路调控中枢“脯氨酸磷酸化事件”的操控者。相关实验证明其特异性抑制剂全反式维甲酸（All-Trans-Retinoic Acid,ATRA）与三氧化二砷（Arsenic Trioxide,ATO）能协同有效地抑制并降解活性Pin1,阻断多个Pin1参与调控的癌症通路,产生显著的肿瘤抑制效果。但,ATRA存在体内半衰期短、水溶性差、对光热敏感等缺陷;ATO存在半衰期短、高毒副作用等缺陷;限制了二者的临床应用。因此,本课题采用生物安全性高,应用前景好的血清白蛋白（Human Serum Albumin,HSA）纳米粒子作为改善ATRA与ATO成药性缺陷的手段。本课题通过构建包载ATRA与ATO的白蛋白纳米粒子,以肝癌为模型,研究并验证了白蛋白-维甲酸-三氧化二砷纳米粒子的药代动力学、急性生物毒性、体内外抑制肿瘤肺转移的作用及机制。试图为临床提供一种安全强效的ATRA协同ATO用药方式,并推动其在实体瘤治疗中的应用进展。方法（1）通过还原去溶剂法构建白蛋白-维甲酸-三氧化二砷（HSA-ATRA-ATO）纳米粒子;通过紫外吸收波长,测试其ATRA药物载量;通过ICP-MS,测试其ATO药物载量;通过动态光散射仪、扫描电镜考察其粒径、电势、形貌;通过直接分散法测定其体外释放情况。（2）在药代动力学与组织分布实验中,利用HPLC-MS测定血浆、组织样品中ATRA浓度;利用ICP-MS测定血浆、组织样品中ATO浓度。通过修饰有荧光基团FITC的HSA纳米粒子,观察HSA纳米粒子的细胞摄取情况。（3）在单次给药150 mg/kg、600 mg/kg剂量条件下,观察48小时小鼠组织学、血液学变化;观察14天内小鼠行为学变化。（4）通过MTT比色法,考察HSA-ATRA-ATO对肝癌细胞增殖抑制效果,确定细胞转移实验浓度;通过细胞转移实验、肝癌肺转移模型等方法,确定ATRA、ATO协同以及纳米粒子抑制肝癌转移的效果;并通过免疫印迹技术,探讨其抑制肝癌转移的机制。结果（1）构建的HSA-ATRA-ATO纳米粒子,溶液细腻、均匀、呈乳黄色;冻干后为干燥、疏松、均匀的粉剂。ATRA载药量在3–5%,包载率约75%;ATO载药量约0.3%,包载率约60%。形态呈圆球型,平均粒径约170 nm;Zeta电位约+20 m V;HSA-ATRA-ATO在DMEM+5%Serum体外环境中释放ATRA至20天;ATO释放至24小时。（2）药代动力学结果显示:HSA-ATRA-ATO缓释效率高;在血液中,ATRA释放延长18 h;在组织中,ATO分布平缓;ATRA药物浓度峰值出现延后3 h。细胞摄取图片显示:HSA-ATRA-ATO吸收快速,24h内吸收量随时间延长逐渐增加。（3）毒性实验中,48 h内组织学、血液学无变化,14天内小鼠行为正常。（4）MTT实验表明HSA-ATRA-ATO纳米粒子有更好的转移抑制效果,并确定以ATRA 10μM,ATO 1μM进行抑制后续实验。细胞转移实验和肺转移模型证明ATRA与ATO协同可发挥更好的肝癌转移抑制效果,且纳米粒子表现较单纯协同更为突出。Pin1与转移相关蛋白变化同细胞实验趋势一致。结论本课题通过还原去溶剂法制备的HSA-ATRA-ATO纳米粒子,性质稳定,安全无毒;能够有效延长ATRA体内半衰期,平衡ATO组织毒性,提高ATRA和ATO的生物利用率。在肝癌模型中,HSA-ATRA-ATO可以有效增强ATRA与ATO协同抑制肿瘤转移的作用,并影响肝癌细胞Pin1和EMT相关蛋白的表达。
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