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摘要：蛋白酶体（Proteases）是一种多亚单位蛋白水解酶复合物，具有可用于治疗和干预的多个靶点。其结构中20S核心包含三种类型的活动站点。在过去的二十年中，已经被FDA批准上市的蛋白酶体抑制剂包括：肽硼酸类药物硼替佐米、肽环氧酮类药物卡非佐米等。本文综述了近年来以共价结合模式发挥药理作用的蛋白酶体抑制剂的研究进展。
关键词：蛋白酶体抑制剂;共价键结合;硼替佐米
泛素-蛋白酶体系统是细胞内蛋白质降解的主要途径，参与细胞内80%以上蛋白质的降解。上世纪70年代末到80年代初，UPS系统由以色列教授阿夫拉姆·赫什科发现，该系统是真核细胞中新合成蛋白质的主要质量控制途[1]。蛋白酶体造成的细胞凋亡是对转化细胞具有一定选择性的，因此，毒性相对较小。本文综述了近年来发现及研究的蛋白酶体活性位点及作用于各活性位点的化合物结构类型其与活性位点的结合方式。
1.蛋白酶体的结构及活性位点
1.1泛素-蛋白酶体的结构
UPS由泛素（ubiquitin， Ub）、26S蛋白酶体及其底物（蛋白质）组成。泛素由E1、E2、E3组成。26S蛋白酶体由20S蛋白水解酶核心和一个或两个19S调节粒子组成。主要的活性位点为β1、β2、β5，是目前蛋白酶体抑制剂的主要作用位点。
1.2蛋白酶体的活性位点
20S蛋白酶体的β1、β2和β5活性位点通过定点突变导致蛋白质降解及扰乱细胞生长。其中，β5位点显然是蛋白质分解中最重要的位点，是最早开发的肽醛抑制剂的主要靶点。研究表明，开发靶向β5位点抑制剂的主要挑战在于提高疏水肽进入细胞的能力。
2.20S蛋白水解位点形成共价键的抑制剂
共价抑制剂通常由一个与活性部位苏氨酸和肽部分相互作用的亲电结构组成。根据不同亲电结构的性质，可以分为八类蛋白酶体抑制剂。
2.1肽醛类
肽醛是第一个被开发的抑制剂，主要由于其低成本，仍然是最广泛使用的。这些快速可逆、有效的抑制剂通过与活性部位苏氨酸的羟基形成半缩醛来阻断蛋白酶体。
2.2肽硼酸类
肽硼酸类蛋白酶体抑制剂比肽醛类更有效。硼酸的结构通过氢键可与活性位点苏氨酸形成四面体复合物[2]。已上市Bortezomib（2，Fig.2）临床上用于治疗多发性骨髓瘤、套细胞淋巴瘤和急性同种异体移植排斥反应，但在最新的研究中表明，Bortezomib可抑制线粒体中一种依赖于ATP的丝氨酸蛋白酶HtrA2/Omi。HtrA2可保护神经元免受凋亡，是使用Bortezomib会引起周围神经毒性的原因，因此对Bortezomib的用药剂量进行限定，也是之后对肽硼酸類抑制剂研究过程中需要克服的问题。
2.3 肽环氧酮类
肽环氧酮类蛋白酶体抑制剂是目前已知的特异性及药效最强的蛋白酶体抑制剂。蛋白酶体位点的N端苏氨酸和肽环氧酮类抑制剂的环氧酮部分可形成一个吗啉环。在癌症治疗的临床试验中，卡非佐米对患者血液中蛋白酶体类β5活性位点的抑制作用强于Bortezomib。在最大耐受剂量下，Bortezomib的抑制不超过70%。卡非佐米在重度预治疗患者群体中获得了显著的缓解率（24%），与Bortezomib相比，周围神经病的发病率大大降低。
2.4肽缩酮醛类
肽缩酮醛类抑制剂（4，Fig.2）发现于20世纪90年代，Grawert等在肽酮醛与酵母蛋白酶体复合物的X射线研究结构表明，肽酮醛与酵母蛋白酶体复合物N端催化苏氨酸可以形成独特的六元环。该环含有半酮基和席夫碱，酮醛也利用了蛋白酶体独特的催化机制。这种特异性，加上席夫碱的可逆性，使这类抑制剂作为高度特异性、可逆性、共价性的抑制剂占据了独特探索点，因此具有较大的研究前景。
2.4β-内酯
β-内酯是最初由碎屑-内囊素-β-内酯（Omuralide）代表的非肽天然产物，在过去的十年中发现了许多β-内酯抑制剂。其中最突出的Marizomib（5，Fig.2）是一种来源于海洋微生物Salinispora tropicn的化合物。Marizomib在临床试验中表现出显著的抑制活性，它对β5活性位点产生更强（高达100%）和更持久的抑制作用，同时对β1及β2活性位点表现出一定的抑制活性。
2.5肽乙烯基砜类
肽乙烯基砜类（6，Fig.2）蛋白酶体抑制剂是由Bogyo等人首次提出的合成的。可通过共价修饰蛋白酶体来催化β亚单位，其共价复合物可通过催化蛋白酶体苏氨酸的羟基与乙烯基砜双键发生迈克尔加成反应。此类抑制剂活性相对较差，对β1位点具有一定的抑制活性，但它们对于活性位点的特异性较高，相对的副作用较弱。因此，该类抑制剂在靶向性研究方面具有较大优势。
2.6Syrbactins类似物
Syrbactin是由一个与肽序列相连的12元内酰胺核心组成。天然化合物紫丁香素A（SylA，7，Fig.2），是植物病原体紫丁香假单胞菌的毒力因子，能够抑制植物和酵母蛋白酶体。但目前对其靶向作用并不明确，鉴于其作用机理与乙烯基砜相似，不能排除对β1活性位点的抑制作用，其活性有待进一步研究
2.7Oxatiazol -2-酮类
在Lin等的研究中表明，Oxatiazol-2-酮类（8，Fig.2）抑制剂可通过不可逆的环羰基化作用抑制分枝杆菌蛋白酶体。这种反应可引起蛋白酶体的构象变化，并且具有一定的稳定性。诱导和稳定构象变化所需的一些关键残基在人蛋白酶体中是不同的，因此这些化合物对分枝杆菌蛋白酶体具有一定的选择性。
3.总结与展望
蛋白酶体抑制剂因其独特的功能性特异性而受到研究者的关注，近20年开发了多种应用于肿瘤的蛋白酶体抑制剂，相信在下一个十年对于蛋白酶体抑制剂的开发不仅仅局限于基于抗肿瘤方向的研究，还可以针对其他疾病例如神经退行性疾病及自身免疫性疾病等。更期待的是新的靶向性更强的甚至可应用多种剂型的蛋白酶体抑制剂用于治疗骨髓瘤和其他癌症的临床实践。
参考文献
1.Girmenia， C.， and G. Barosi. et al .2019）. "Management of Infectious Complications in Multiple Myeloma Patients： Expert Panel Consensus-Based Recommendations." Blood Rev 34： 84-94.
2.Groll， M.， and Ovaa， H. et al. （2016）. Crystal structure of the boronic acid-based proteasome inhibitor bortezomib in complex with the yeast 20S proteasome. Structure 14， 451–456.
关键词：蛋白酶体抑制剂;共价键结合;硼替佐米
泛素-蛋白酶体系统是细胞内蛋白质降解的主要途径，参与细胞内80%以上蛋白质的降解。上世纪70年代末到80年代初，UPS系统由以色列教授阿夫拉姆·赫什科发现，该系统是真核细胞中新合成蛋白质的主要质量控制途[1]。蛋白酶体造成的细胞凋亡是对转化细胞具有一定选择性的，因此，毒性相对较小。本文综述了近年来发现及研究的蛋白酶体活性位点及作用于各活性位点的化合物结构类型其与活性位点的结合方式。
1.蛋白酶体的结构及活性位点
1.1泛素-蛋白酶体的结构
UPS由泛素（ubiquitin， Ub）、26S蛋白酶体及其底物（蛋白质）组成。泛素由E1、E2、E3组成。26S蛋白酶体由20S蛋白水解酶核心和一个或两个19S调节粒子组成。主要的活性位点为β1、β2、β5，是目前蛋白酶体抑制剂的主要作用位点。
1.2蛋白酶体的活性位点
20S蛋白酶体的β1、β2和β5活性位点通过定点突变导致蛋白质降解及扰乱细胞生长。其中，β5位点显然是蛋白质分解中最重要的位点，是最早开发的肽醛抑制剂的主要靶点。研究表明，开发靶向β5位点抑制剂的主要挑战在于提高疏水肽进入细胞的能力。
2.20S蛋白水解位点形成共价键的抑制剂
共价抑制剂通常由一个与活性部位苏氨酸和肽部分相互作用的亲电结构组成。根据不同亲电结构的性质，可以分为八类蛋白酶体抑制剂。
2.1肽醛类
肽醛是第一个被开发的抑制剂，主要由于其低成本，仍然是最广泛使用的。这些快速可逆、有效的抑制剂通过与活性部位苏氨酸的羟基形成半缩醛来阻断蛋白酶体。
2.2肽硼酸类
肽硼酸类蛋白酶体抑制剂比肽醛类更有效。硼酸的结构通过氢键可与活性位点苏氨酸形成四面体复合物[2]。已上市Bortezomib（2，Fig.2）临床上用于治疗多发性骨髓瘤、套细胞淋巴瘤和急性同种异体移植排斥反应，但在最新的研究中表明，Bortezomib可抑制线粒体中一种依赖于ATP的丝氨酸蛋白酶HtrA2/Omi。HtrA2可保护神经元免受凋亡，是使用Bortezomib会引起周围神经毒性的原因，因此对Bortezomib的用药剂量进行限定，也是之后对肽硼酸類抑制剂研究过程中需要克服的问题。
2.3 肽环氧酮类
肽环氧酮类蛋白酶体抑制剂是目前已知的特异性及药效最强的蛋白酶体抑制剂。蛋白酶体位点的N端苏氨酸和肽环氧酮类抑制剂的环氧酮部分可形成一个吗啉环。在癌症治疗的临床试验中，卡非佐米对患者血液中蛋白酶体类β5活性位点的抑制作用强于Bortezomib。在最大耐受剂量下，Bortezomib的抑制不超过70%。卡非佐米在重度预治疗患者群体中获得了显著的缓解率（24%），与Bortezomib相比，周围神经病的发病率大大降低。
2.4肽缩酮醛类
肽缩酮醛类抑制剂（4，Fig.2）发现于20世纪90年代，Grawert等在肽酮醛与酵母蛋白酶体复合物的X射线研究结构表明，肽酮醛与酵母蛋白酶体复合物N端催化苏氨酸可以形成独特的六元环。该环含有半酮基和席夫碱，酮醛也利用了蛋白酶体独特的催化机制。这种特异性，加上席夫碱的可逆性，使这类抑制剂作为高度特异性、可逆性、共价性的抑制剂占据了独特探索点，因此具有较大的研究前景。
2.4β-内酯
β-内酯是最初由碎屑-内囊素-β-内酯（Omuralide）代表的非肽天然产物，在过去的十年中发现了许多β-内酯抑制剂。其中最突出的Marizomib（5，Fig.2）是一种来源于海洋微生物Salinispora tropicn的化合物。Marizomib在临床试验中表现出显著的抑制活性，它对β5活性位点产生更强（高达100%）和更持久的抑制作用，同时对β1及β2活性位点表现出一定的抑制活性。
2.5肽乙烯基砜类
肽乙烯基砜类（6，Fig.2）蛋白酶体抑制剂是由Bogyo等人首次提出的合成的。可通过共价修饰蛋白酶体来催化β亚单位，其共价复合物可通过催化蛋白酶体苏氨酸的羟基与乙烯基砜双键发生迈克尔加成反应。此类抑制剂活性相对较差，对β1位点具有一定的抑制活性，但它们对于活性位点的特异性较高，相对的副作用较弱。因此，该类抑制剂在靶向性研究方面具有较大优势。
2.6Syrbactins类似物
Syrbactin是由一个与肽序列相连的12元内酰胺核心组成。天然化合物紫丁香素A（SylA，7，Fig.2），是植物病原体紫丁香假单胞菌的毒力因子，能够抑制植物和酵母蛋白酶体。但目前对其靶向作用并不明确，鉴于其作用机理与乙烯基砜相似，不能排除对β1活性位点的抑制作用，其活性有待进一步研究
2.7Oxatiazol -2-酮类
在Lin等的研究中表明，Oxatiazol-2-酮类（8，Fig.2）抑制剂可通过不可逆的环羰基化作用抑制分枝杆菌蛋白酶体。这种反应可引起蛋白酶体的构象变化，并且具有一定的稳定性。诱导和稳定构象变化所需的一些关键残基在人蛋白酶体中是不同的，因此这些化合物对分枝杆菌蛋白酶体具有一定的选择性。
3.总结与展望
蛋白酶体抑制剂因其独特的功能性特异性而受到研究者的关注，近20年开发了多种应用于肿瘤的蛋白酶体抑制剂，相信在下一个十年对于蛋白酶体抑制剂的开发不仅仅局限于基于抗肿瘤方向的研究，还可以针对其他疾病例如神经退行性疾病及自身免疫性疾病等。更期待的是新的靶向性更强的甚至可应用多种剂型的蛋白酶体抑制剂用于治疗骨髓瘤和其他癌症的临床实践。
参考文献
1.Girmenia， C.， and G. Barosi. et al .2019）. "Management of Infectious Complications in Multiple Myeloma Patients： Expert Panel Consensus-Based Recommendations." Blood Rev 34： 84-94.
2.Groll， M.， and Ovaa， H. et al. （2016）. Crystal structure of the boronic acid-based proteasome inhibitor bortezomib in complex with the yeast 20S proteasome. Structure 14， 451–456.