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大菱鲆是一种非常名贵的海洋鱼种,它生长迅速并且味道十分鲜美,从而深受人们的喜爱。然而,目前鱼类的病害问题已成为限制海水鱼类养殖业可持续发展的主要因素,其中哈维氏弧菌是海水养殖动物(鱼、虾)的重要致病菌,给海水养殖业造成了巨大的经济损失。为解决养殖鱼的病害问题,增强养殖种类的抗病力,必须对病原菌和鱼类免疫系统之间的相互作用关系有全面的了解。然而,鱼类的许多免疫/抗病相关基因尚不清楚。由于大多数免疫/抗病相关基因并非组成型表达,而是受病原物感染影响的诱导型表达,因此如能分析免疫细胞基因在病原物感染时的差异表达,就有可能发现和鉴别新的免疫/抗病相关基因,并在分子水平上阐明免疫细胞和病原菌之间的相互作用关系。抑制消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术是Diatchenko等以mRNA差别显示技术为基础建立起来的筛选未知的差异表达基因的新技术,它主要基于抑制PCR,并结合标准化(normalization)和消减杂交(subtractive hybridization,SH)技术。它克服了mRNA差异显示技术的假阳性高和代表性差别分析法的消减杂交轮次较多的缺点,十分适用于分析造成某种特殊表性的目的基因及其功能,从而成为差异表达基因筛选最有潜力的新方法。本文运用SSH技术比较了经哈维氏弧菌感染的和未受感染的大菱鲆差异表达基因。利用Trizol试剂分别从对照组和实验组中提取肾组织和脾组织的总RNA,将同一组的总RNA混合并分离、纯化mRNA,构建双向SSH差减文库,克隆差减片断,对阳性克隆片断测序分析及GenBank同源性检索。共鉴定出49个差异片段,通过与GenBank数据库的比对,发现这些基因片段大部分为免疫相关基因,包括主要组织相容性复合体基因、热激蛋白基因、信号蛋白基因等。其中,一个差异片段被证实为主要组织相容性复合体MHC classⅠa基因(登陆号EF032639),通过RACE技术获得其全长的cDNA,测序并分析其编码产物的性质。该基因序列全长1466 bp,包含一个1062 bp的开放阅读框,编码354个氨基酸。5’UTR长127 bp ,3’UTR长277 bp,并且在3’UTR区poly-A尾1185 bp处含有一多聚腺苷酸信号序列ATTAAA。经比对后发现,MHC class Ia氨基酸序列与牙鲆、青鳉鱼、虹鳟、大西洋真鳕、红鳍东方鲀、鸡、鼠、和人的同源性分别为68%, 54%, 51%, 52%, 57%, 33%, 29%, 29%。荧光实时定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累积来检测PCR产物。实时荧光定量PCR技术通过检测PCR产物中荧光讯号强度来达到定量的目的,该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃,而且与常规PCR相比,它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点。本文采用了SYBR Green I荧光染料,通过相对定量中的双标准曲线法,以大菱鲆看家基因β-actin为内参进行校正,比较了经哈维氏弧菌感染的和未受感染的大菱鲆中MHC class Ia基因的表达量的差异。结果显示,大菱鲆的MHC class Ia在受到哈维氏弧菌感染后表达量有所上升,表达量上升为原来的4倍,证明MHC class Ia在大菱鲆的免疫反应中发挥了作用。