病虫害是农业生产中重要的危害之一，现代农业生产过程中主要通过施用农药来控制病虫害。而农药长期大量的施用，不仅会污染生态环境，带来一系列生态问题，同时,农药残留也给人们的健康带来巨大危害。在此之前,大量的研究集中于农药施用过程中对空气造成的污染和对操作者身体健康的影响，而关于农药施用到农作物上之后,对农作物本身所带来的影响，却较为缺乏。关于施用农药对作物DNA甲基化及基因表达的影响方面的研究更为缺乏。多菌灵是一种重要的杀菌剂，在农业生产中得到了广泛的应用。本研究以拟南芥为材料，研究多菌灵对拟南芥亲代（T0代）及子代（T1代）基因组DNA甲基化变化和基因表达的影响。以多菌灵处理拟南芥培养基,设置了4个浓度梯度0m mol/l(CK),0.05m mol/l（D1），0.1m mol/l(D2),0.2m mol/l(D3)。对处理材料进行了生长和生理生态检测以及AFLP，MSAP分子标记检测。并对CK，D2，D3三个处理进行了基因甲基化芯片和基因组表达谱芯片分析。结果如下：　　1.多菌灵对T0代的影响　　与对照相比,多菌灵处理20d的拟南芥植株叶片有略微增厚，卷曲的现象；主根显著变短，侧根明显增多；叶片叶绿素含量有显著增加。　　生长20d的幼苗(不含根)DNA用AFLP法（共使用8对引物）,共扩增出776条可统计条带，这些条带中未出现多态性位点，说明处理组与对照组之间的基因组序列保持一致，多菌灵处理拟南芥没有诱导出本方法可以检测到的遗传变异。　　经过MSAP分析，与对照相比，0.05m mol/l多菌灵处理（D1）基因组DNA的甲基化率为0.862％，去甲基化率为0.69%。与对照（CK）相比，0.1m mol/l多菌灵处理（D2）基因组DNA甲基化率为0.871%，去甲基化率为0.871%。与对照相比,0.2m mol/l多菌灵处理（D3）基因组DNA甲基化率为1.193%,去甲基化率为1.363%。　　使用拟南芥全基因组甲基化芯片分析全基因组范围内基因启动子区域甲基化情况发现，对照CK有甲基化区域6671个，D2有甲基化区域6690个，D3有7193个。其中D2相对于对照发生甲基化增加的区域有1541个,去甲基化的区域有1522个，甲基化率为0.4%，去甲基化率为0.395%。D3相对于对照发生甲基化增加的区域有2790个，去甲基化的区域有2278个，发生甲基化率为0.725%，去甲基化率为0.592%。两处理均发生甲基化增加的区域有472个，占总数的0.123%，两处理均发生去甲基化的区域有872个，占总数的0.226%。其中还发现有转录因子基因启动子发生了甲基化变化。其中16个甲基化程度增加的，11个甲基化程度减少。　　拟南芥基因组DNA表达谱芯片分析发现，多菌灵处理引起基因表达的改变，D2相对于对照表达上调2倍的基因有1618个,下调2倍的有1194个。D3相对于对照,表达上调2倍的基因有2665个，下调2倍的有3081个。一些基因的表达变化也引起相关代谢通路的变化。生物信息学功能数据库KEGG做pathway分析，这些基因表达变化共涉及到32个信号通路的变化。其中D2涉及到21个，D3涉及到25个信号通路。D2、D3均受到影响的通路有14个。　　DNA甲基化芯片和表达谱芯片联合分析表明,D2发生去甲基化且表达上调的基因有46个，D3发生去甲基化且表达上调的基因有80个，两个多菌灵添加处理均发生去甲基化且表达上调的基因有21个。D2发生重新甲基化且表达下调的基因有45个，D3发生重新甲基化且表达下调的基因有71个，两个多菌灵处理材料均发生重新甲基化且表达下调的基因有3个。　　从甲基化芯片和表达谱芯片联合分析结果里，挑取与生长发育和逆境刺激相关的几个基因，其发生去甲基化引起了表达上调。AN3、ATFER4、BT4、MEK1、SPL8这5个基因进行实时荧光PCR验证分析。结果显示,多菌灵处理的样本中这5个基因的表达与对照相比均有不同程度的上调，这与芯片检测结果是基本相符的。　　经过甲基化与表达谱数据比对分析,我们发现多菌灵或参与启动拟南芥防御基因表达的路径,多菌灵使得该途径中初始几个关键基因（AT1G35710，EFR，VSR6，MEKK1，MEK1）发生去甲基化,引起其表达极显著上调,最终引起防御基因（PAD3，NUDT6，FRK1，NHO1）的表达大幅上调,这是世界上农药启动植物防御系统的首例报道。也是第一次比较完整的推理出多菌灵启动植物防御系统的作用通路。　　2.多菌灵处理对拟南芥子代(T1)的影响　　多菌灵处理过的亲本的子代发育正常，侧根较多。而对照则发现污染率高，苗相对较弱。AFLP分子标记检测，共用了8对引物，扩增出528条带，结果发现，两处理与对照相比，均未发现有多态性的条带，表明亲代苗经多菌灵处理后，子代苗的基因组没有发生本方法可检测的DNA序列变异。　　经过MSAP分析，0.1m mol/l多菌灵处理（D2）的子代(D2T1)与对照（CKT1）相比，全基因组的甲基化率为0.475%，去甲基化率为0.634%。0.2m mol/l多菌灵处理（D3T1）与对照相比,甲基化率为1.08%,去甲基化率为1.235%。　　芯片分析全基因组范围内基因启动子区域甲基化情况发现，D2T1相对于对照发生甲基化增加的区域有2218个,去甲基化的区域有3075个，D3T1相对于对照发生甲基化增加的区域有3500个，去甲基化的区域有4269个。另外，D2T1代对照相比保持与去甲基化的有591个区域,保持甲基化增加的区域有353个。D3T1代保持去甲基化的有147个区域,保持甲基化增加的有207个区域。　　为了验证甲基化芯片结果,挑选了在芯片分析中发生去甲基化的4个基因进行了甲基化特异性PCR检测，检测结果表明多菌灵处理组的这4个基因均发生了去甲基化，这与芯片检测结果是一致的。同时这4个基因的表达也发生了不同程度的上调。　　子代多菌灵处理组与对照相比，基因表达差异也普遍存在。D2与对照相比，表达上调2倍的基因有3108个，下调2倍的有3429个；而D3与对照相比，表达上调2倍的基因有4381个，下调2倍的有4651个。　　D2与对照相比，有30个基因在T1代保持了甲基化增加并且表达水平下调2倍以上，21个基因保持了去甲基化并且表达水平上调2倍以上。D3处理与对照相比，有9个基因保持甲基化增加并表达下调，11个基因保持了去甲基化并表达上调。其中一些基因DNA甲基化与基因表达关联性变化与亲代相同。其中涉及的代谢通路与T0代基本相同。　　由上述结果,我们还看到,虽然上一代基因的甲基化有大约5-10%遗传给了下一代,但是却只有大约0.5%的基因的甲基化继续影响了该基因的表达状况。　　3.结论　　(1)施用多菌灵使拟南芥亲代（T0）基因组DNA发生了广泛的去甲基化和重新甲基化。　　(2)多菌灵施用导致拟南芥全基因组范围基因表达发生了显著的变化，一些代谢途径也因此受到显著影响。　　(3)多菌灵添加可能通过启动并影响病菌与植物相互作用通路中的几个关键基因去甲基化而使下游的防御基因表达上调,最终达到杀死致病菌的目的。　　(4)拟南芥子代(T1)的表型和DNA甲基化状况仍然受到亲代(T0)施用多菌灵的影响，部分基因的DNA甲基化状态改变遗传到了下一代。　　(5)子代基因组的基因表达谱与对照相比仍然有显著差异。同时，一些基本代谢通路以及次生代谢途径受到显著的影响。而且子代的基因表达富集通路和T0代基本一致。　　(6)两代的甲基化芯片数据与表达谱芯片数据进行联合分析，均发现一部分基因的DNA甲基化状况改变，影响到了该基因及相关基因的表达变化。有些基因在亲代和子代均有相同的甲基化状态改变及相似的表达水平变异。