论文部分内容阅读
目的:脓毒症作为危重病患者的主要死亡原因之一,具有病死率及发病率高、发病机制复杂、缺乏特异性治疗手段的特点,而且花费巨大,给家庭及社会造成很重的负担,因此揭示脓毒症的发病机制,找到合理的治疗方法是急需解决的问题。目前已经证实免疫抑制及炎症反应失控为脓毒症致机体不可逆损害的主要病生机制之一。TGF-β1作为免疫抑制因子,可以抑制T、B淋巴细胞的增值及活化、下调自然杀伤细胞的活性、调节单核巨噬细胞的功能及多种细胞因子如IL-1、IL-2的生成并拮抗它们的功能,但其在炎症反应失控方面的作用机制尚未阐明,特别是其对脓毒症相关信号传导通路的影响。IL-10可抑制单核-巨噬细胞的活化和抗原提呈功能,阻止Th-1细胞激活的抗原提呈细胞合成细胞因子,从而抑制免疫炎症反应。TNF-α又称恶质素,主要由单核-巨噬细胞分泌,是一种重要的促炎因子本实验通过RNAi技术,抑制单核细胞内源性TGF-β1的表达,来观察该免疫细胞分泌促炎因子(TNF-α)及抗炎因子(IL-10)的变化,初步探讨TGF-β1对这两种功能相反的细胞因子的影响,从而为进一步研究TGF-β1调节脓毒症相关信号传导通路的机制及其在炎症反应中的作用提供新方法,为攻克脓毒症这一顽疾寻找新思路。方法:1、瞬时转染外源性siRNA进入人单核细胞白血病细胞株THP-1,沉默该细胞内源性TGF-β1基因的表达。将体外培养的细胞随机分成4组:①30nMsiRNA组;②50nMsiRNA组;③阴性对照组(NC组);④空白对照组(常规培养)。转染24小时后收集各组细胞,涂片,在荧光显微镜下观察细胞转染效果。用试剂盒提取细胞总RNA,RT-PCR技术检测TGF-β1在基因水平的沉默效果。转染48小时后收集各组细胞,用试剂盒提取细胞总蛋白,BCA蛋白定量,WB技术检测细胞TGF-β1蛋白抑制情况。2.ELISA法检测各组细胞培养基中TNF-α及IL-10浓度变化。3、数据结果应用SPSS16.0统计软件进行分析,P<0.05为有统计学差异。结果:①在荧光显微镜下观察,细胞内有绿色荧光,50nMsiRNA组比30nMsiRNA组含绿色荧光的细胞多;②RT-PCR结果示30nMsiRNA组、NC组、空白组均在288bp处有一亮的条带,50nMsiRNA组在此处条带亮度较弱。应用labworks灰度分析软件,对比内参(β-actin)IOD值,计算相对表达量,与对照组相比,50nMsiRNA组TGF-β1mRNA下降显著,P<0.05,有统计学差异;而30nMsiRNA组与对照组相比无统计学意义。抑制率约为46%;③WB结果示50nMsiRNA组蛋白条带较其它三组暗,应用labwork灰度分析软件,对比内参(β-actin)IOD,与对照组相比,50nMsiRNA组TGF-β1蛋白表达量下降,P<0.05,有统计学差异;④50nMsiRNA组细胞TNF-α较对照组升高,P<0.05,具有统计学意义;⑤IL-10各组间无明显变化,P>0.05,无统计学意义。结论:①基于RNAi技术,利用阳离子脂质体介导,瞬时转染人单核细胞株THP-1外源性TGF-β1干扰片段,可在基因及蛋白水平成功抑制内源性TGF-β1的产生;②TGF-β1可抑制促炎因子TNF-α的产生;③TGF-β1对抑炎因子IL-10的产生无影响。