TGF-β1对BM-MSCs增殖和分泌TGF-β1的影响

来源 :昆明医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:shuijing0328
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[目的]间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)可通过免疫抑制特性减轻器官移植术后的免疫排斥反应,MSCs分泌的转化生长因子β 1(transforming growth factor,TGF-β 1)在发挥免疫抑制中起到重要作用并且影响细胞的增殖和分泌功能,但TGF-β 1对人骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BM-MSCs)的增殖和BM-MSCs表达TGF-β 1的影响尚未明确。本课题通过运用不同浓度TGF-β 1处理影响BM-MSCs,并通过实时定量聚合酶链锁反应(Quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR)、CCK8 法及Elisa、蛋白免疫印记实验(Western Blot)等方法明确TGF-β 1对BM-MSCs增殖及BM-MSCs分泌TGF-β 1的影响和机制研究。[方法]1.首先选用购进的骨髓间充质干细胞进行细胞复苏、计数、传代、冻存。培养后分离BM-MSC s重新接种以进一步扩增。选取生长状态良好的P3-4代BM-MSCs用于实验。通过Western-blot及Elisa法检测BM-MSCs的TGF-β 1表达。2.将BM-MSCs接定量种于DMEM完全培养基中进行培养并补充不同浓度的TGF-β 1及TGF-β 1受体抑制剂,期间通过CCK8检测分析TGF-β1对BM-MSCs增殖的影响。3.在不同浓度TGF-β 1处理BM-MSCs后,通过Elisa及qRT-PCR检测经TGF-β1处理后的BM-MSCs自身分泌TGF-β 1的表达量。4.不同浓度TGF-β 1浓度对BM-MSCs进行处理后,Western-blot检测BM-MSCs中细胞外调节蛋白激酶1/2(ERK1/2),并计算磷酸化ERK1/2相对表达量。[结果]Western-blot检测经BM-MSCs提取的总蛋白,Elisa法检测BM-MSCs培养基上清液,检测结果显示BM-MSCs自身能够表达TGF-β 1并分泌至细胞外。CCK8法检测细胞增殖情况的实验结果显示较低浓度TGF-β 1(2ng/ml、5ng/ml)培养能够促进BM-MSCs的增殖,而较高浓度TGF-β 1(10ng/ml)培养环境则抑制BM-MSCs的增殖,且上述BM-MSCs的增殖水平变化在加入TGF-β 1受体抑制剂后被减弱。通过qRT-PCR及Elisa法检测发现经(2ng/ml、5ng/ml)TGF-β1处理能够促进BM-MSCs自身在基因水平和蛋白水平TGF-β 1的表达量(5ng/ml TGF-β1实验组最明显),且加入TGF-β 1受体抑制剂能使促进效果减弱。经适量浓度TGF-β 1(2ng/ml、5ng/ml)处理能够提高BM-MSCs中磷酸化ERK1/2的相对表达量,且促进作用在5ng/ml TGF-β 1实验组中表现得最明显。[结论]1.BM-MSCs自身能够表达并分泌TGF-β1,适量浓度的TGF-β 1(2ng/ml、5ng/ml)处理能够促进BM-MSCs增殖,而较高浓度的TGF-β 1处理(10ng/ml)则能够抑制BM-MSCs的增殖适量浓度(2ng/ml、5ng/ml)的TGF-β 1处理能够促进BM-MSCs的TGF-β 1 mRNA表达和细胞上清液中的TGF-β 1分泌量。ERK1/2信号转导通路可能参与介导了 TGF-β 1调节BM-MSCs增殖和调节BM-MSCs 表达 TGF-β 1。
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