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【目的】 1. 利用 circRNA测序技术在年轻和衰老的人脐静脉内皮细胞( human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)中筛选和鉴定差异表达的circRNAs。 2. 探讨衰老相关circRNA ciPVT1影响血管内皮细胞衰老的分子机制。 【方法】 1. 利用circRNA测序技术检测年轻与衰老HUVECs中circRNAs的表达。根据circRNAs表达水平、差异倍数等条件初步筛选circRNAs。 2. 针对circRNA拼接位点设计反向引物,利用qRT-PCR方法验证在测序结果中差异表达的circRNAs(差异倍数≥2)。通过PCR产物测序及RNase R处理验证circRNAs的成环特性。 3. 在HUVECs中转染特异性小干扰RNA(siRNA)抑制ciPVT1的表达,分别利用SA-β-gal、BrdU、小管形成等实验观察抑制ciPVT1对血管内皮细胞衰老、增殖、血管形成能力的影响。 4. 利用RNA pull-down及蛋白质谱技术鉴定与ciPVT1特异性结合的蛋白,并通过String网站分析这些结合蛋白的相互作用网络。 【结果】 1. 测序结果显示,衰老中上调的 circRNAs 有 5271 条,衰老中下调的circRNAs有1808条(差异倍数≥2.0,P<0.05)。 2. qRT-PCR分析结果显示ciPVT1等circRNAs在衰老中下调,而circDLG1等circRNAs在衰老中上调,与circRNA测序结果一致。PCR产物测序结果及RNase R处理实验证明ciPVT1等circRNAs具有成环特性。 3. 特异性siRNA能够显著抑制ciPVT1的表达,而不影响其线性lncRNA PVT1 的表达。在年轻 HUVECs 细胞中下调 ciPVT1 的表达,可以显著促进HUVECs细胞衰老、抑制细胞增殖和血管形成的能力。 4. 在年轻的HUVECs中利用RNA pull-down及蛋白质谱技术分析得到与ciPVT1 特异性结合的蛋白质,其中 Peroxiredoxin-1、HSPA8 和 Plakophilin-1等涉及 DNA 损伤修复和抗氧化应激等衰老相关通路。最后对这些结合蛋白进行String分析,发现这些蛋白可以形成一个相互作用的调控网络。 【结论】 环状RNA ciPVT1在衰老的HUVECs中低表达。在年轻的HUVECs中沉默ciPVT1的表达可促进细胞衰老,抑制细胞增殖和血管形成能力。ciPVT1可能通过与细胞内Peroxiredoxin-1、HSPA8和Plakophilin-1等衰老相关蛋白相结合,从而调控血管内皮细胞衰老的进程。