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目前我国是全球30个结核病的高负担国家之一,每年新发的结核病患者约90万例,位居全球第3位。目前一线抗结核药主要包括异烟肼(isoniazid,INH,H)、利福平(rifampin,RFP,R)、乙胺丁醇(ethambutol,EMB,E),吡嗪酰胺(pyrazinamide,PZA,Z),由于抗结核治疗时间较长,药物种类多,患者容易出现多种不良反应。抗结核药是临床上常见的引起药物性肝损伤的药物,一直以来,人们对抗结核药物致肝损伤的相关机制的研究颇多,但是目前仍然没有明确。原卟啉Ⅸ(ProtoporphyrinⅨ,PpⅨ),即游离原卟啉,是在亚铁血红素的生物合成途径过程中合成的最后一个中间体,同时也是一种内源性肝毒性物质,在生理条件下,肝内PpⅨ的生物转化或转运迅速,一旦PpⅨ的体内平衡被破坏,肝脏将成为受损的主要器官。有研究显示RFP与INH联用时在肝脏中造成的PpⅨ蓄积与介导了亚铁血红素的生物合成途径的孕甾烷X受体(PXR)有关。亚铁螯合酶(FECH),是血红素生物合成途径的末端酶,它可催化亚铁离子与PpⅨ环的螯合形成血红素原,是人体内亚铁血红素合成的唯一的关键酶,FECH的缺失或者活性抑制,会影响和阻碍体内亚铁血红素的合成进而引起PpⅨ的蓄积。目的本项课题主要是研究PpⅨ蓄积与结核病人服用抗结核药物期间产生肝损害的相关性,研究在PpⅨ蓄积过程中抗结核药物HRZE(INH、RFP、PZA、EMB)对孕甾烷X受体、亚铁螯合酶产生影响的相关机制。并最终以此作为抗结核药物引发肝损害的实验室指标,推广用于临床,从而保障结核病人用药的有效性和安全性。方法课题分为以下两个部分:第一部分临床水平上原卟啉Ⅸ蓄积与HRZE致肝损伤的相关性及部分机制研究收集结核病人血样,实验分三组:对照组(未服用抗结核药物)、治疗组1(服用抗结核药物HRZE未发生肝功能损害)与治疗组2(服用抗结核药物HRZE发生肝功能损害),采用荧光分光光度计法测定三组患者血液中PpⅨ的浓度,分析PpⅨ的蓄积与抗结核药物FECH致肝功能损害的相关性。抗结核药物HRZE联合用药致PpⅨ的蓄积,认为PpⅨ的积聚与孕烷X受体(PXR)的激动有关。CYP3A4是孕烷X受体的底物,CYP3A4的蛋白表达量可反映出PXR的表达。服用抗结核药物后的患者血清内CYP3A4浓度可反映出PXR的表达。通过对三组结核病人血清CYP3A4的浓度检测,结果可反映PpⅨ的积聚和PXR激动的相关性。通过检测三组结核病人血清FECH浓度、锌原卟啉浓度,结果可反映PpⅨ的蓄积与FECH酶浓度及活性的相关性。第二部分孕烷X受体、亚铁螯合酶在HRZE致原卟啉Ⅸ蓄积中相关机制的体外研究在HepG2细胞水平上,分别予以INH、RFP、PZA、EMB加药处理,通过Western blot方法来检验不同分组CYP3A4的蛋白表达量,结果可反映出PXR的表达,证明了PXR的激动与PpⅨ在体内蓄积的相关性。通过分别给予INH、RFP、PZA、EMB加药处理后体外细胞中FECH浓度检测,结果可反映HRZE对FECH酶蛋白表达水平的影响。通过5-ALA分别联合INH、RFP、PZA、EMB加药处理后体外细胞中PpⅨ浓度检测,结果可反映HRZE对FECH酶的抑制作用。分别将INH、RFP、PZA、EMB与FECH进行分子对接,研究四种药物与FECH分子间是否能够紧密结合。体外FECH分别给予INH、RFP、PZA、EMB加药处理后,检测FECH在Fe2+与PpⅨ合成亚铁原卟啉过程中的活性变化,进一步验证INH、RFP、PZA、EMB对FECH的影响情况。结果临床试验结果表明结核病人给予HRZE治疗方案后发生肝损伤者体内PpⅨ水平、血清CYP3A4浓度、血清锌原卟啉浓度显著升高(P<0.01),各组间FECH的浓度无统计学差异(P>0.05),说明HRZE相关肝损伤与PpⅨ蓄积相关,HRZE可激动PXR,对FECH存在活性抑制作用。体外细胞试验结果显示:Hep G2细胞予以INH、RFP、PZA、EMB分别加药处理后,RFP组CYP3A4的蛋白表达升高明显,具有统计学差异(P<0.01),其他加药组与正常组相比无统计学差异(P>0.05),表明RFP可激动PXR活性;FECH浓度在各组间无显著变化(P>0.05)。体外细胞加入5-ALA后PpⅨ合成增加,其中INH+5-ALA组PpⅨ增加明显,与ALA组比较差异有统计学意义(P<0.05),其他加药组与ALA比较无明显差异(P>0.05)。分子对接结果提示HRZE四药中仅INH可与FECH进行分子间紧密结合,同时体外FECH分别给予INH、RFP、PZA、EMB加药处理后,INH组Fe2+与PpⅨ合成亚铁原卟啉较正常组明显减少(P<0.01),均表明INH对FECH存在明显的抑制作用。结论HRZE相关肝损伤与PpⅨ蓄积有关,其中PpⅨ蓄积主要与RFP激动PXR、INH抑制FECH活性有关。