家蚕几丁质酶基因选择性剪切及表达的研究

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几丁质是自然界中最重要的生物高分子之一。它是昆虫外骨骼的主要结构组分,保护昆虫免于环境伤害和捕食,维持昆虫个体的形态,另一方面它能保护中肠的上皮细胞免于饮食成分的机械损伤和病原体造成的生物损伤,同时可作为消化腔调节渗透性,酶定位和消化产物。昆虫生长和形态发生改变受几丁质酶的严格限制。昆虫在不同组织中不断生产几丁质合酶和几丁质酶,几丁质合成和分解的协调需要发育过程中参与酶的严格调控。对昆虫几丁质酶的结构、形成、分类和作用机理的研究非常有意义。   本论文在分析大量家蚕组织EST数据、基因组数据等的基础上,利用RT-PCR法克隆了家蚕几丁质酶(BmCHT)基因的选择性剪接体BmCH73,并分别验证了BmCHT基因的选择性剪接体BmCHT1、BmCHT2和BmCHT4等3种不同mRNA选择性剪接体的形式,发现BmCHT1的ORF全长2337bp,编码566个氨基酸,5’端非翻译区(5’-UTR)和3’端非翻译区(3’-UTR)分别为4bp和635bp。BmCHT2的ORF全长2850bp,编码565个氨基酸,5’端非翻译区(5’-UTR)和3’端非翻译区(3’-UTR)分别为4bp和1151bp。BmCHT3的ORF全长1706bp,编码543个氨基酸,5’端非翻译区(5’-UTR)和3’端非翻译区(3’-UTR)分别为4bp和70bp。BmCHT4的ORF全长2791bp,编码544个氨基酸,5’端非翻译区(5’-UTR)和3’端非翻译区(3’-UTR)分别为4bp和1158bp。分析了BmCHT基因的结构,显示BmCHT基因由10个外显子和9个内含子组成,10个外显子大小分别为65、170、166、223、124、198、297、201、75、1339bp,9个内含子分别长1343、514、5499、724、1217、359、540、1150、861bp,内含子和外显子的边界序列都符合典型的GT/AG规则。家蚕与赤拟谷盗,果蝇等昆虫几丁质酶基因功能域的进化树分析结果显示,昆虫几丁质酶基因按功能域进化树分类可分为五大类,家蚕BmCHT基因的4种mRNA选择性剪接体与果蝇的DmCHT5和赤拟谷盗的TcCHT5都属于第2大类。通过设计家蚕BmCHT基因4种mRNA选择性剪接体的特异引物,利用RT-PCR法分析了家蚕BmCHT基因在不同组织、不同发育时期的表达变化,显示BmCHT基因在表皮组织和中肠组织中表达较高,在血球和丝腺中基本不表达;在5龄幼虫期食桑期基本不表达,熟蚕期(S0)开始表达并增大。
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