基于适配体的编码探针构建及其偶联微流控芯片用于多类污染物的同时分析方法研究

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近年来,在食品的生产和加工过程中,食品安全卫生问题频频出现。食品中的污染物往往是多类共存,对人类的健康将造成直接或潜在的危害。常见的食品污染物有化学性污染物,包括兽药、农药残留,霉菌毒素污染等;以及生物性污染物,包括副溶血性弧菌、沙门氏菌等食源性致病菌。因此,研究一系列能快速同时地筛查食品中多类污染物的方法对于保障人民生活质量和安全具有十分重要的意义。然而,现有的食品污染物的检测方法,如色谱方法,免疫学方法等,分别存在着检测时间长、检测成本高、样品前处理复杂、灵敏度低等客观问题,难以满足食品安全监测便携化、快速化和低成本的要求。微流控芯片由于响应速度快、便携式、分析成本低和高通量的特点,近年来在分析分离领域备受关注和青睐。本论文提出基于适配体编码探针偶联微流控芯片平台,结合磁性分离技术和滚环扩增(RCA)信号放大策略,开发了一系列快速、高灵敏、高通量、低成本和特异性的方法实现食品中多类污染物的同时分析研究。具体研究内容如下:1.基于滚环扩增技术偶联微流控芯片的比率型传感器检测卡那霉素的研究在这项研究中,开发了一种新型的基于微流控芯片的比率型适配体传感器,通过使用搅拌棒辅助滚环扩增(RCA)策略对卡那霉素(KANA)的高灵敏定量分析,在很大程度上放大信号并克服食品样品中复杂的基质干扰。其检测机理如下:首先在金搅拌棒上修饰大量DNA杂交双链体(一条是引物链,用于触发RCA反应;另一条互补的是KANA的适配体链)。在存在KANA的情况下,由于KANA与适配体之间的特异性结合,引物链从杂交探针上取代下来并释放到上清液中。引物链可以与环状DNA模板(CDT)反应并触发RCA反应,以产生许多不同长度的单链产物。随着反应的进行,CDT的量不断减少(因为CDT与RCA产物互补),RCA产物的数量增加。使用数量最多的一串RCA产物链(RPS)作为代表性RCA产物。所有RCA产物和CDT都可以通过微流控芯片电泳(MCE)轻松分离。通过RPS和CDT的比率信号(IR/IC),可用于在0.8 pg·mL-1至10 ng·mL-1的宽线性范围内对KANA进行定量,检出限低至0.3 pg·mL-1。本方法具有极好的灵敏度、选择性,并通过比例策略与搅拌棒提取相结合,可以显著降低基质干扰。设计的传感器已成功在牛奶和鱼类样品中进行了测试,与酶联免疫吸附测定方法(ELISA)检测结果一致,证实可以用于食品中抗生素残留的现场定量分析。2.基于磁性三联体DNA纳米组装偶联微流控芯片同时响应卡那霉素、黄曲霉毒素M1和雌二醇的定量检测本项研究开发了一种基于微流控芯片的适配体传感器平台,结合磁性三联体DNA结构功能化的纳米复合材料,用于同时检测牛奶中的卡那霉素(KANA),黄曲霉毒素M1(AFM1)和17β-雌二醇(E2)。首先在磁珠的表面上组装了三联体DNA纳米结构。当探针上的适配体识别特异性靶标后,适配体链将被释放到上清液中。同时,磁珠上的预引物@CDT模板结构可以通过phi 29聚合酶启动RCA。磁分离后,将磁性纳米复合材料添加到包含三段不同长度的无标记互补链的溶液中,使其各自互补组装到RCA产物的单链上。互补链的数量将大大减少,通过这三种互补链信号探针的减少值,实现对应目标物的间接检测,并且这三种互补链可以通过MCE轻松分离和定量。设计的传感器可测定KANA,AFM1和E2,检出限分别低至0.32 pg·mL-1、0.95 pg·mL-1和6.8 pg·mL-1。最后使用ELISA进行KANA标准检测,采用高效液相色谱法(HPLC)进行AFM1和E2标准检测,并将结果与本方法进行比较,显示了良好的一致性。本策略具有出色的稳定性和快速同时响应时间(在微流控芯片平台上不到3分钟)的优势,可用于测定牛奶样品中的KANA,AFM1和E2,并确保食品安全。3.基于磁性纳米探针的比色和微流控芯片双模式适配体传感器用于同时测定副溶血性弧菌和鼠伤寒沙门氏菌由微生物引起的食源性疾病已日益引起全球关注。在本文研究中,开发了灵敏和即时的比色和微流控芯片双模式适体传感器,与磁性纳米探针相结合,可同时测定副溶血性弧菌和鼠伤寒沙门氏菌。比色适体传感器首先被用于检测细菌中的ATP,这是因为细菌ATP检测可以验证微生物污染。滚环扩增产物(RP)共轭磁性复合捕获探针(RMNPs)被用作捕获探针,并且G4序列可以催化TMB的氧化,导致肉眼可见的颜色变化,而无需依赖任何复杂的仪器,可以反映细菌的浓度。在验证了食品中的细菌污染后,使用微流控芯片平台进一步分析了鼠伤寒沙门氏菌和副溶血性弧菌的准确定量。RMNPs和Eco RV核酸内切酶策略被用作信号捕获,扩增和区分元件。结果表明,提出的比色和微流控芯片双模式适体传感器有望实现在现场即时定性细菌污染,并同时检测食品中的多种食源性致病细菌。
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