研究背景与目的胃癌（gastric cancer,GC）是最常见的消化道恶性肿瘤之一,其全球发病率居第5位,死亡率居第3位。我国是胃癌高发病区之一,每年新发例数约40万例,总体死亡率呈逐年上升趋势。并且由于多数胃癌患者早期症状不典型、无特异性,确诊时已处于中晚期,即进展期胃癌,临床疗效欠佳,预后差,5年生存率低,严重危害国人身体健康。化疗是目前胃癌常见的治疗方式,但由于化疗药物副作用大、不良反应多以及肿瘤耐药率高等问题,限制了其在胃癌治疗中的应用。因此,开发新型化疗药物,寻求有效联合治疗方案,以期改善当前胃癌治疗现状尤为重要。近年来,毛琅科植物黑种草籽越来越受到人们重视。其药用价值高,从其提取的多种生物学物质,具有抗氧化、抗炎、免疫调节、抗菌、抗肿瘤等活性。而百里醌（Thymoquinone,TQ）,就是从黑种草籽中提取并纯化的一种活性单体。多项研究证实,百里醌可参与调控多种肿瘤细胞的生物学行为,包括结直肠癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌等,可显著抑制肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移,诱导肿瘤细胞凋亡。此外,百里醌在体外和体内实验均能增强5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil,5-FU）诱导结肠癌细胞凋亡的活性,还可增强常规化疗药物吉西他滨对胰腺癌的抗肿瘤作用,但具体作用机制不明。而顺铂是胃癌治疗的基础药物,通过干扰DNA修复,引起DNA损伤,进而诱导肿瘤细胞凋亡。但目前单用顺铂的疗效并不理想,经过顺铂治疗后复发的肿瘤患者耐药率高。多项研究发现,联合治疗（基于顺铂）的抗肿瘤疗效显著优于单用顺铂,包括卵巢癌、胃癌、食管癌、肺癌、胰腺癌等。因此,人们越来越重视顺铂联合治疗肿瘤策略在临床上的应用,以期改善肿瘤治疗现状。PI3K/AKT信号通路是参与细胞增殖调控的重要通路之一,其在肿瘤的发生发展中常被异常地激活,是关键的“驱动因子”。该条通路由许多个亚单位和激酶组成的,因此为癌症的治疗提供了许多潜在的靶点。肿瘤抑癌基因PTEN（phosphatase and tension homlog,PTEN）基因于1997年首次被发现,其表达产物具有蛋白质磷酸酶和脂质磷酸酶双重活性,可使PIP3去磷酸化成为无活性的PIP2,阻止AKT的活化,从而抑制了PI3K/AKT信号通路的激活,发挥其抑癌作用。在人类的多种恶性肿瘤中,广泛存在PTEN基因突变、缺失或者启动子超甲基化等发生。但目前关于PTEN基因在胃癌发生发展的作用研究甚少。研究表明,Wnt/β-catenin通路异常激活与肿瘤的侵袭和迁移能力密切相关,且GSK-3β作为该信号通路的重要负向调节因素,其活性可受到PI3K/AKT信号通路的密切调控。多项研究证实,PI3K/AKT信号通路活性改变在百里醌抗肿瘤过程中发挥了重要作用。百里醌可通过靶向PI3K/AKT信号通路,改善肿瘤耐药细胞对阿霉素和多西他赛的敏感性。本课题组前期研究已证实,百里醌可在体内外抑制胃癌细胞增殖,诱导胃癌细胞发生凋亡。我们推测,百里醌可能通过上调PTEN基因调节PI3K/AKT信号通路活性,实现增强胃癌细胞对顺铂敏感性作用,并且,PTEN基因很可能在胃癌的侵袭和迁移过程中发挥了重要作用。因此,本课题在前期研究基础上,进一步研究百里醌联合顺铂对胃癌细胞生物学行为的影响,同时探索了PTEN基因调控胃癌的发生发展的作用机制,在动物水平也证实了百里醌和顺铂的抗胃癌作用。第一部分,运用百里醌和顺铂处理人胃癌细胞系（HGC-27、SGC-7901、MGC-803）,检测两者对胃癌增殖和凋亡的影响,通过CCK-8、克隆形成、Hoechst 33258染色法、流式凋亡染色及Western blot等方法,同时构建了稳定转染的胃癌细胞系,探究百里醌对胃癌细胞对顺铂的敏感性的影响及作用机制;第二部分,进一步探讨了PTEN基因调控胃癌细胞侵袭和迁移的具体机制;第三部分,通过构建裸鼠胃癌皮下移殖瘤体内实验模型,予以裸鼠腹腔注射百里醌和顺铂,探讨两者联合治疗在裸鼠体内对胃癌细胞增殖与凋亡的影响。材料与方法1、选取人胃癌细胞系（HGC-27、SGC-7901、MGC-803）为研究对象,分别不同浓度的百里醌（0、5、10、20、40、80μM）和/或顺铂（0、0.25、0.5、1、2、4μg/m L）处理人胃癌细胞24h,通过CCK-8法检测百里醌和/或顺铂对人胃癌细胞增殖能力的影响,用Grah Pad软件计算两种药物对胃癌细胞增殖抑制率和药物的IC50,用calcusyn 2.0软件分析百里醌和顺铂是否协同抑制胃癌细胞增殖;以终浓度为空白、5μM百里醌、2μg/ml顺铂、5μM百里醌+2μg/ml顺铂作用于人胃癌细胞24h,运用CCK-8、克隆形成实验、流式细胞术、及Hochest 33258染色等方法检测百里醌和顺铂对胃癌细胞增殖和凋亡的影响;百里醌和顺铂刺激胃癌细胞24h后,western blot检测细胞内PTEN、p-AKT、AKT、P-gp、Bax、Bcl-2、Cyt C、AIF等蛋白变化。2、构建敲低PTEN的稳定细胞系,干扰胃癌细胞PTEN的表达后,予以该细胞系百里醌和顺铂刺激,运用CCK-8、克隆形成、Hoechst33258凋亡染色及western blot验证百里醌是否通过上调PTEN基因,增强胃癌细胞对顺铂的敏感协同发挥抗胃癌的作用。3、购置胃癌组织芯片（含48例胃癌患者的癌与癌旁组织标本）,采用免疫组化法检测PTEN和β-catenin蛋白在胃癌和癌旁组织中的表达,研究其与胃癌患者临床病理学特征的关系,进一步进行两者表达在胃癌组织中的相关性分析;以胃癌细胞系HGC-27和SGC-7901为研究对象,构建稳转细胞系,敲低PTEN基因的表达,通过划痕实验、Matrigel侵袭试验研究PTEN基因在调控胃癌侵袭和迁移中的作用;通过PTEN和β-catenin免疫荧光染色,western blot检测PTEN、AKT、p-AKT,、p-GSK-3β、β-catenin、E-cadherin等蛋白表达差异,最后用明胶酶谱法分析干扰胃癌细胞PTEN基因表达后胃癌细胞MMP-2和MMP-9的活性变化。4、选取人胃癌SGC-7901细胞系,PBS重悬细胞调整细胞浓度4×10~7/m L,接种至裸鼠后背部皮下（每只裸鼠接种体积100μL）,构建裸鼠胃癌皮下移植瘤模型后,将裸鼠随机进行分组,腹腔注射生理盐水、顺铂、百里醌以及百里醌和顺铂联合,观察裸鼠状态和瘤体的生长情况并做好记录,间隔2天给药,给药10次后,去眼球取血,离心取上清检测裸鼠肝肾功能,断颈椎处死裸鼠,分离剥除皮下移植瘤,称瘤体重量,取裸鼠肝脏、脾脏、脑以及肺组织行HE染色,并绘制瘤体生长曲线、TUNEL法检测移植瘤细胞凋亡情况、免疫组织化学方法检测PTEN蛋白的表达变化。结果1、用梯度浓度的百里醌（0、5、10、20、40、80μM）刺激胃癌细胞系（SGC-7901、HGC-27和MGC-803）24h,CCK-8检测发现,百里醌可抑制胃癌细胞增殖,且呈浓度依赖性。三种胃癌细胞系中,SGC-7901对百里醌最敏感。在百里醌浓度为5μM时,对3种胃癌细胞无明显的细胞毒性作用,细胞存活率约为90%,故而选择该浓度进行预处理。百里醌（5μM）预处理的胃癌细胞后,予以顺铂（0、0.2 5、0.5、1、2、4μg/m L）刺激24h,百里醌和顺铂联合组抑制胃癌细胞活力的IC 50值显著低于单用顺铂组,差异有统计学意义（P＜0.05）。运用Calcusyn 2.0软件分析联合指数（cmbination index,CI）提示百里醌和顺铂具有协同抑制胃癌细胞增殖的作用。克隆形成实验中,克隆形成数空白组169.3±10.6,百里醌组126.3±11.6,顺铂组120.0±3.6,联合组49±6.9,提示联合组可显著抑制胃癌细胞克隆形成（P＜0.05）。在Hoechst33258染色实验中,两个单药组诱导的细胞凋亡率明显高于对照组（P＜0.05）,同时我们发现,联合处理组诱导凋亡的细胞比例高于任一单药组（P＜0.05）。流式PE/7-AAD细胞凋亡染色结果显示,早、晚期凋亡率与对照组（1.77%和5.23%）、TQ（3.47%和9.58%）、顺铂（11.24%和22.15%）相比,联合处理组的SGC-7901细胞早、晚期凋亡率明显升高,分别为19.15%和63.5%。Western blot结果示,与对照组相比,随着百里醌浓度升高,PTEN蛋白表达逐渐升高,AKT蛋白表达无差异,但p-AKT,P-gp表达明显下降;进一步的,与单药组相比,联合处理组PTEN蛋白表达显著升高,p-AKT和P-gp表达明显下降,凋亡相关蛋白Bax、Cyt C、AIF、cleaved caspase-3、cleaved caspase-7、cleaved caspase-9等表达显著升高,但抗凋亡相关蛋白Bcl-2、procaspase-3、procaspase-7和procaspase-9等表达明显下降（P＜0.05）。上述一些列研究结果表明,百里醌可能通过上调PTEN基因负向调控AKT信号通路从而实现在体外与顺铂协同发挥抗胃癌的作用。2、构建敲低PTEN基因表达的胃癌细胞系SGC-7901/HGC-27/MGC-803-PTEN-sh RNA,并设立空白对照SGC-7901/HGC-27/MGC-803-NC,检测予以顺铂和/或百里醌刺激。CCK-8实验中,单用顺铂刺激细胞发现,与对照组相比,干扰PTEN表达的胃癌细胞对顺铂的敏感性降低,同一顺铂浓度刺激下,后者细胞活力更高;同样地,联合组刺激细胞发现,与对照组相比,干扰PTEN表达胃癌细胞对药物刺激的敏感性降低,同一药物刺激下,后者细胞活力更好。克隆形成实验发现,敲低PTEN基因,联合组细胞克隆形成率升高（P＜0.05）。Hoechst33258染色结果示:联合组刺激胃癌细胞24h,我们发现干扰PTEN表达后细胞的凋亡率降低,差异有统计学意义（P＜0.05）。Western blot实验中,与阴性对照组相比,敲低PTEN,顺铂和联合组p-AKT蛋白水平升高,P-gp蛋白表达降低,而Bax cleaved caspase 3 cleaved caspase 9等凋亡蛋白显著水平降低,差异均有统计学意义。上述实验结果表明,百里醌能增强胃癌细胞对顺铂的敏感性,而敲低PTEN表达,能减弱百里醌的这种作用。3、免疫组化结果显示,PTEN在大多数胃癌组织中的低表达,且与胃癌患者的分化程度密切相关。进一步分析发现,胃癌组织中PTEN与β-catenin蛋白表达呈负相关（r=-0.546,P＜0.01）。此外,划痕实验及Transwell小室侵袭实验显示,敲除PTEN基因表达,促进了胃癌细胞的迁移和侵袭,westen blot检测发现,干扰PTEN表达,胃癌细胞的p-AKT、p-GSK-3β、β-catenin、E-cadherin、MMP-7、MMP-2和MMP-9蛋白表达上调,明胶酶谱实验提示干扰PTEN表达,人胃癌细胞MMP-2和MMP-9活性升高。4、裸鼠胃癌细胞皮下移植瘤体内实验中,24只裸鼠成功构建皮下移植瘤模型,随机分为四组,予以腹腔注射药物,分别为对照组、顺铂组、百里醌组、百里醌和顺铂联合用药组。移植瘤逐渐生长,待给药结束,处死动物并取材,剥离瘤体测量其长径和短径,计算瘤体体积为（以上四组依次）:1214.92±207.99 mm~3,845.01±53.09mm3,582.49±75.43mm~3,345.99±54.83mm~3,提示与单药组相比,联合组可显著抑制瘤体生长,差异有统计学意义（P＜0.05）。瘤体重量:联合组对肿瘤生长有更强的抑制作用,肿瘤重量显著低于单药组（P＜0 5）。进一步TUNEL检测发现:联合组凋亡率显著增高（P＜0.05）。免疫组化结果显示,联合组PTEN蛋白表达水平升高,且高于单药组。上述裸鼠体内实验结果表明:百里醌能上调PTEN基因表达,从而增强顺铂的抗肿瘤作用。结论百里醌通过上调PTEN信号通路,增强胃癌对顺铂的敏感性,从而发挥其与顺铂在体内和体外协同抗肿瘤的作用。PTEN基因还可通过调节AKT/GSK-3β/β-catenin信号通路介导胃癌细胞侵袭和迁移。