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背景与目的:鼻咽癌（NPC）是一种鼻咽部由粘膜上皮细胞恶变而来,具有较高恶性程度的头颈部癌症。据国际癌症调查显示,大多数鼻咽癌患者具有显著的地理区域和人种聚集特征。在泰国、越南、中国南方以及北非地区鼻咽癌的发病率明显较高,而在其他地方则表现为散在发病的分布特点。这些流行病学和病因学特征共同证实了基因失调在鼻咽癌的发生发展中占有重要地位。随着鼻咽癌新的筛查方式和诊疗技术的推广应用,鼻咽癌整体病死率较前有明显下降。然而,在鼻咽癌高发地区,此类恶性肿瘤对人类健康造成的危害仍不容忽视。原位复发和远处转移仍然是当前造成鼻咽癌患者死亡的主要因素。因此,深入探究基因功能失调在鼻咽癌发生、发展中的作用,对于我们进一步认识和防治此类疾病具有深远意义。本研究首先从鼻咽癌组织芯片测序出发,结合转录组学、蛋白组学公共数据库分析筛选可能在鼻咽癌进展中发挥作用的靶基因CENP-N;其次,本研究结合基因编辑技术对鼻咽癌细胞中CENP-N表达进行干预后研究其对鼻咽癌细胞体内外生物学行为的影响;最后我们探讨了CENP-N影响鼻咽癌相关恶性生物学行为的分子机制。本研究内容分为以下三个部分:第一部分:基于大数据筛选及临床样本验证鼻咽癌中致癌基因CENP-N的表达及意义研究目的:探究鼻咽癌与对照组织的差异表达基因,筛选影响鼻咽癌患者生存相关的靶基因。研究方法:1.从GEO数据库中挑选的2张鼻咽癌组织芯片通过GEO2R在线工具进行二次分析,筛选鼻咽癌中的差异表达基因。随后,对鼻咽癌中差异表达的候选基因进行蛋白互作网络分析和Cytoscape可视化操作进一步筛选可能影响鼻咽癌的Hub基因。2.采用Kaplan-Meier Plot和GEPIA数据库分析这些Hub基因与头颈鳞癌患者预后的关系。3.采用免疫荧光染色、蛋白免疫印迹（Western blot）和免疫组化方法检测鼻咽癌和鼻咽炎患者组织中CENP-N的表达水平。4.分析CENP-N表达和鼻咽癌患者PET/CT检查18F-FDG的摄取关系;分析CENP-N表达与鼻咽癌患者预后相关性。5.采用Western blot方法检测不同鼻咽癌细胞系（HK-1、5-8F、SUNE-1、CNE-2Z、6-10B）与永生化上皮细胞NP460中CENP-N蛋白表达。研究结果:1.从2张芯片中共筛选出568个共同的差异表达基因,包括207个上调基因和361个下调基因。根据PPI和可视化分析筛选出37个候选Hub基因。2.在Kaplan–Meier plotter数据库筛选出20个与头颈鳞癌患者预后相关的Hub基因,最终在GEPIA数据库选择出3个核心差异基因:ANLN、CDK1和CENP-N。3.免疫荧光、Western blot和免疫组化染色结果表明CENP-N在鼻咽癌组织中表达水平升高（P＜0.05）。4.与低表达CENP-N鼻咽癌患者相比,高表达CENP-N患者原发病灶肿瘤葡萄糖摄取量增高（P＜0.05）。在鼻咽癌患者中,高表达CENP-N者预后差（P＜0.05）。5.CENP-N在多种鼻咽癌细胞系中表达水平均高于NP460（P＜0.05）。研究结论:CENP-N在鼻咽癌组织和细胞中表达量均显著升高。鼻咽癌患者生存时间与CENP-N的表达呈负相关。高表达CENP-N鼻咽癌患者肿瘤的葡萄糖摄取量增加。第二部分:CENP-N在体内外促进鼻咽癌细胞葡萄糖代谢、细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡抵抗研究目的:探究CENP-N表达变化对鼻咽癌中葡萄糖代谢、细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡的影响。研究方法:1.利用慢病毒包装含有CENP-N-sh RNA的质粒感染并构建敲低CENP-N基因的稳定转染鼻咽癌细胞。2.采用转录组测序方法检测敲低CENP-N后对鼻咽癌细胞功能基因表达、信号通路调节和生物学功能的影响。3.采用q RT-PCR和Western blot方法检测敲低CENP-N后对两株鼻咽癌细胞系相关生物学功能基因m RNA和蛋白表达的影响。采用葡萄糖测定、乳酸检测、CCK8、克隆形成、流式细胞术检测敲低CENP-N基因对体外环境下鼻咽癌细胞葡萄糖代谢、增殖、周期和凋亡的影响。4.建立鼻咽癌裸鼠皮下移植瘤模型,通过小动物PET/CT检测敲低CENP-N对在体条件下鼻咽癌细胞增殖、葡萄糖摄取和糖酵解的影响。采用免疫荧光、免疫组织化学染色以及Western blot检测体内环境下敲低CENP-N基因对鼻咽癌细胞葡萄糖代谢、周期和凋亡相关蛋白的影响。研究结果:1.在鼻咽癌细胞5-8F和CNE-2Z中成功构建空载组和两个CENP-N的转录本敲低的细胞:sh NC、sh CENP-N1和sh CENP-N2。2.敲低CENP-N以后影响的基因富集在葡萄糖代谢和细胞周期调节等细胞功能上。3.相对于sh NC细胞,敲低CENP-N后,鼻咽癌细胞5-8F和CNE-2Z中HK2、GLUT1、ENO1、PFKFB2、PFKFB3、c-MYC、Ki67、PCNA、CDK2、Cyclin D1、Cyclin E1和Bcl-2 m RNA表达均下调,而Bax和Caspase-3 m RNA表达上调（P＜0.05）。相对于sh NC细胞,敲低CENP-N后,鼻咽癌细胞中HK2、GLUT1、Ki67、PCNA、CDK2、Cyclin D1和Bcl-2蛋白下调,而Bax蛋白上调。相对于sh NC组,鼻咽癌细胞中sh CENP-N1和sh CENP-N2均表现为葡萄糖摄取减少,乳酸产生水平下降,克隆增殖能力减弱,周期出现G0/G1期阻滞和凋亡比例显著上调（P＜0.05）。4.相对于sh NC组,在体条件下鼻咽癌细胞5-8F和CNE-2Z中敲低CENP-N后均表现为肿瘤生长速度,最终裸鼠皮下移植瘤重、肿瘤最大标准化葡萄糖摄取、肿瘤平均葡萄糖摄取和总葡萄糖酵解量均显著下调（P＜0.05）。相对于sh NC组,在体条件下鼻咽癌细胞中敲低CENP-N后均表现为HK2、GLUT1、Ki67、PCNA、CDK2、Cyclin D1和Bcl-2表达下调,而Bax表达上调（P＜0.05）。研究结论:敲低CENP-N在体内外条件下均能显著抑制鼻咽癌细胞有氧糖酵解和细胞存活与增殖能力,促进鼻咽癌细胞周期阻滞和细胞凋亡。第三部分:CENP-N/AKT1促进鼻咽癌细胞恶性生物学行为的分子机制研究目的:探究CENP-N参与调节鼻咽癌细胞中葡萄糖代谢、细胞存活与增殖能力、细胞周期和细胞凋亡的分子机制。研究方法:1.采用Western blot方法检测敲低CENP-N后对AKT、JNK和P53信号通路的影响。2.采用q RT-PCR检测敲低CENP-N后AKT各亚型m RNA表达变化。采用免疫荧光、免疫组化、Western blot检测在体条件下鼻咽癌细胞中敲低CENP-N后AKT1 S473磷酸化蛋白的表达变化。3.采用细胞免疫荧光检测CENP-N与AKT1细胞定位情况。4.采用免疫共沉淀和GST pull-down实验检测鼻咽癌细胞中CENP-N与AKT1的蛋白相互作用情况。5.采用葡萄糖测定、乳酸检测、CCK-8、克隆形成、流式细胞术检测AKT1抑制剂MK-2206能否阻断过表达CENP-N后鼻咽癌细胞在葡萄糖代谢、细胞增殖能力、细胞周期进程和细胞凋亡方面发生的变化。6.采用生物信息学方法预测CENP-N的转录调节因子。7.在5-8F和CNE-2Z细胞中构建敲低IRF2的鼻咽癌细胞,并通过Western blot检测干预IRF2后鼻咽癌细胞CENP-N蛋白表达水平的变化。8.采用染色质免疫共沉淀（Ch IP）实验检测IRF2与CENP-N启动子序列的关系。9.采用双荧光素酶报告实验检测IRF2对CENP-N的转录调控作用。研究结果:1.相对于sh NC组,sh CENP-N1和sh CENP-N2组的AKT、JNK和P53信号通路均发生变化,其中以AKT信号通路变化最为显著,且主要影响的是AKT1 S473磷酸化位点。2.相对于sh NC组,sh CENP-N1和sh CENP-N2组的AKT1、AKT2、AKT3 m RNA表达量均下调,其中AKT1的变化最为显著（P＜0.05）。在鼻咽癌中敲低CENP-N能显著降低AKT1及S473位点磷酸化蛋白的表达（P＜0.05）。3.细胞免疫荧光显示在5-8F和CNE-2Z细胞系中,CENP-N和AKT1有蛋白共定位表达。4.CENP-N与AKT1在细胞中存在直接的蛋白与蛋白相互作用。5.MK-2206能阻断过表达CENP-N对5-8F和CNE-2Z细胞有氧糖酵解、细胞存活和增殖能力、细胞周期进程的促进以及对细胞凋亡的抑制作用（P＜0.05）。6.IRF2可能与CENP-N启动子序列存在结合位点。IRF2表达量与CENP-N成正相关（P＜0.05）。7.在5-8F和CNE-2Z细胞中,相对于sh NC组,sh IRF2组CENP-N蛋白表达均明显下调（P＜0.05）。8.转录因子IRF2能与CENP-N的的启动子序列直接结合。9.鼻咽癌细胞中IRF2能促进CENP-N的转录。研究结论:CENP-N通过调节鼻咽癌细胞中AKT1及S473位点磷酸化促进鼻咽癌细胞有氧糖酵解、增殖、细胞周期和凋亡抵抗。IRF2是CENP-N转录因子,能促进鼻咽癌细胞中CENP-N基因表达。