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临床资料显示,90%的肝细胞癌(HCC)具有肝硬化背景,并且与肝硬化相关的HCC患者死亡率仍在上升。细胞外蛋白质的大量沉积增加了细胞外基质(ECM)的刚度,从而改变细胞所处的力学微环境。HCC是一种转移率较高且预后差的恶性癌症,目前针对HCC的治疗方案选择较少且效果有限。癌细胞转移作为肿瘤预后不良的主要因素,是攻克肿瘤的重难点。上皮间充质转化(EMT)是一个使肿瘤细胞获得转移能力的复杂过程,其进程几乎在所有转移性癌症中都有发生,能够使癌细胞获得运动能力,迁移到邻近组织。研究表明,SNF5在多种恶性肿瘤中表达受到抑制,其在肿瘤细胞ECM的重塑和细胞转移能力的抑制中起重要作用。但是,力学微环境变化对于SNF5及EMT进程有何影响,以及力学微环境下SNF5如何调控EMT均不清楚。基于此,本课题拟以HepG2细胞为实验对象,通过将PDMS预聚物和固化剂以30∶1、10∶1比例混合制备成不同硬度的3D结构基底,以模拟ECM硬度变化下的力学微环境。首先通过Western blot实验和qPCR技术检测30∶1和10∶1的3D结构基底上HepG2细胞中EMT相关蛋白和SNF5的表达。其次,构建过表达或敲低SNF5的HepG2稳定细胞株,通过Western blot实验和qPCR技术分析这两种细胞株中EMT有关蛋白的表达情况,并将过表达SNF5的HepG2细胞接种在30∶1和10∶1的3D结构上,采用Western blot实验对EMT有关蛋白的表达进行检测。最后,通过Transwell实验法对过表达或敲低SNF5的细胞迁移能力和侵袭能力进行检测,并将过表达SNF5的HepG2细胞接种在30∶1和10∶1的3D结构上,应用Western blot检测迁移侵袭相关蛋白的表达。本课题实验内容与实验结果如下:
①基底硬度对HepG2细胞EMT进程和SNF5表达的影响:将HepG2细胞接种在30∶1和10∶1的3D结构基底上,采用Western blot实验和qPCR技术分析EMT有关蛋白和SNF5的表达。实验结果表明,在较硬基底上HepG2细胞中E-cad的表达受到抑制,N-cad和VIM的表达被诱导,即基底硬度增加促进了HepG2细胞EMT进程;在较硬基底上SNF5表达下调,表明基底硬度增加抑制了SNF5的表达。
②力学微环境下SNF5对HepG2细胞EMT的影响:构建过表达或敲低SNF5的HepG2稳定细胞株,应用Western blot实验以及qPCR技术分析EMT相关蛋白的表达,结果表明过表达SNF5,E-cad的表达被诱导,N-cad和VIM的表达受到抑制,敲低SNF5的HepG2细胞中EMT相关蛋白的表达趋势则相反,说明SNF5抑制HepG2细胞EMT进程;将过表达SNF5的HepG2细胞接种在30∶1和10∶1的3D结构基底上,应用Western blot分析EMT有关蛋白的表达,结果表明,在10∶1较硬基底上过表达SNF5,HepG2细胞的E-cad上调,N-cad和VIM下调,说明SNF5抑制由10∶1较硬基底诱导的EMT进程。
③力学微环境下SNF5对肝癌细胞HepG2的迁移及侵袭的影响:对HepG2细胞过表达或敲低SNF5,通过Transwell实验法统计其中迁移及侵袭的细胞量,结果表明,过表达SNF5后,迁移和侵袭的细胞数量减少;而抑制SNF5后,迁移和侵袭的细胞数量增多,即SNF5抑制HepG2细胞的迁移和侵袭能力;将过表达SNF5的HepG2细胞接种在30∶1和10∶1的3D结构基底上,通过Western blot实验检测迁移侵袭相关蛋白的表达,结果表明,在10∶1较硬基底上,HepG2细胞的MMP9、MMP2和VEGFA的表达上调,而过表达SNF5抑制了10∶1较硬基底表达上调的MMP9、MMP2和VEGFA,即力学微环境下SNF5抑制迁移侵袭有关分子的表达。
①基底硬度对HepG2细胞EMT进程和SNF5表达的影响:将HepG2细胞接种在30∶1和10∶1的3D结构基底上,采用Western blot实验和qPCR技术分析EMT有关蛋白和SNF5的表达。实验结果表明,在较硬基底上HepG2细胞中E-cad的表达受到抑制,N-cad和VIM的表达被诱导,即基底硬度增加促进了HepG2细胞EMT进程;在较硬基底上SNF5表达下调,表明基底硬度增加抑制了SNF5的表达。
②力学微环境下SNF5对HepG2细胞EMT的影响:构建过表达或敲低SNF5的HepG2稳定细胞株,应用Western blot实验以及qPCR技术分析EMT相关蛋白的表达,结果表明过表达SNF5,E-cad的表达被诱导,N-cad和VIM的表达受到抑制,敲低SNF5的HepG2细胞中EMT相关蛋白的表达趋势则相反,说明SNF5抑制HepG2细胞EMT进程;将过表达SNF5的HepG2细胞接种在30∶1和10∶1的3D结构基底上,应用Western blot分析EMT有关蛋白的表达,结果表明,在10∶1较硬基底上过表达SNF5,HepG2细胞的E-cad上调,N-cad和VIM下调,说明SNF5抑制由10∶1较硬基底诱导的EMT进程。
③力学微环境下SNF5对肝癌细胞HepG2的迁移及侵袭的影响:对HepG2细胞过表达或敲低SNF5,通过Transwell实验法统计其中迁移及侵袭的细胞量,结果表明,过表达SNF5后,迁移和侵袭的细胞数量减少;而抑制SNF5后,迁移和侵袭的细胞数量增多,即SNF5抑制HepG2细胞的迁移和侵袭能力;将过表达SNF5的HepG2细胞接种在30∶1和10∶1的3D结构基底上,通过Western blot实验检测迁移侵袭相关蛋白的表达,结果表明,在10∶1较硬基底上,HepG2细胞的MMP9、MMP2和VEGFA的表达上调,而过表达SNF5抑制了10∶1较硬基底表达上调的MMP9、MMP2和VEGFA,即力学微环境下SNF5抑制迁移侵袭有关分子的表达。