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肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma, HCC,以下简称肝癌)是世界上最常见的恶性肿瘤之一。多药耐药使肝癌患者的术后化疗效果十分有限,这一直是遏制肝癌预后改善的关键问题。肝癌作为实体肿瘤,缺氧是肝癌细胞生存的真实微环境,而缺氧也是导致肝癌多药耐药的因素之一。因此,深入研究缺氧微环境下肝癌多药耐药的机制并积极探索有效的逆转多药耐药的治疗手段,对于进一步改善肝癌患者的治疗效果及生存率具有极其重要的意义。近年来星形胶质细胞提升基因-1(astrocyte elevated gene-1, AEG-1)在肿瘤多药耐药中的作用逐渐引起人们的关注。AEG-1是新发现的癌基因,位于与多种恶性肿瘤的发生密切相关的人类8号染色体(8q22)上,研究表明其是促进肿瘤发生发展的一个关键因子。AEG-1是可以通过调控PI3K/Akt、NF-κB等多条信号途径参与正常细胞转化,肿瘤细胞增殖、侵袭、转移,血管生成等肿瘤发生发展的多个环节,并能介导肿瘤细胞自噬活性和化疗耐药。有研究认为,AEG-1可能是通过某些信号通路的调控来影响多药耐药基因-1(multidrug resistance gene1, MDR1)的表达,从而参与介导肿瘤多药耐药,但其具体作用机制目前尚不清楚。本课题首先在肝癌组织、癌旁肝组织及正常肝组织标本中检测AEG-1、MDR1的表达情况。然后研究在缺氧微环境下AEG-1的表达情况及其对MDR1表达、肝癌细胞系HepG2多药耐药性的影响；进而通过RNA干扰技术,在缺氧微环境下特异性抑制肝癌细胞系HepG2中AEG-1的表达水平,并综合利用一系列分子生物学和细胞生物学的方法研究AEG-1调控肝细胞癌多药耐药的可能分子机制。第一章AEG-1、MDR1在正常肝组织、癌旁肝组织及肝癌中的表达情况目的了解AEG-1在正常肝组织、癌旁肝组织及肝癌组织中表达情况及其与MDRl表达的相关性方法(1)免疫组化检测30例肝癌组织、30例癌旁肝组织及8例正常肝组织中AEG-1、MDR1蛋白的表达情况。(2)实时荧光定量PCR (qRT-PCR)方法检测AEG-1、MDR1mRNA在30例新鲜肝癌组织及其配对的癌旁肝组织中的表达水平,8例新鲜正常肝组织作为对照。结果(1)免疫组化法检测结果显示,肝癌组织中的AEG-1、MDR1蛋白阳性表达明显高于癌旁肝组织和正常肝组织(P<0.01)。而在癌旁肝组织和正常肝组织之间,两者阳性表达情况无显著性差异。(2) qRT-PCR检测结果显示,肝癌新鲜组织中AEG-1、MDR1mRNA表达水平均明显高于癌旁肝组织和正常肝组织,差异均具有显著性(P<0.01)。而癌旁肝组织和正常肝组织之间,AEG-1、MDR1mRNA表达水平差异无统计学意义。(3)根据免疫组化结果对AEG-1、MDR1两者之间相关性研究得出r=0.725,P<0.05；而根据qRT-PCR检测结果进行相关性分析得出r=0.758,P<0.01。结论AEG-1、MDR1基因在肝癌组织中高表达；而在癌旁肝组织和正常肝组织中均呈低表达。肝癌组织中AEG-1和MDR1的表达之间存在相关性,提示AEG-1对MDR1的表达存在调控关系。第二章缺氧微环境下AEG-1表达对HepG2多药耐药的影响目的探讨缺氧微环境下AEG-1的表达及其对HepG2多药耐药的影响方法(1)常氧下HepG2作为对照组(A组)；以100umol/L的CoCl2作用于肝癌细胞HepG2构建细胞缺氧模型作为实验组(B组)；常氧下正常肝细胞L02作为正常对照组(C组)。(2) qRT-PCR、Western blotting检测各组细胞中AEG-1、MDR1mRNA和蛋白在0h、24h、48h表达量。(3)MTT法检测ADM、5-Fu、DDP在A、B两组细胞中的48hIC50结果(1) qRT-PCR方法检测结果显示,A组HepG2肝癌细胞株中的AEG-1、MDR1mRNA表达量明显高于C组LO2细胞株(P<0.01)；B组HepG2肝癌细胞株中的AEG-1、MDR1mRNA表达量明显高于A组HepG2肝癌细胞株(P<0.01)。(2) Western blotting方法检测结果显示,A组HepG2肝癌细胞株中的AEG-1、MDR1蛋白表达量明显高于C组L02细胞株(P<0.01)；B组HepG2肝癌细胞株中的AEG-1、MDR1蛋白表达量明显高于A组HepG2肝癌细胞株(P<0.01)。(3)MTT法检测结果显示,B组ADM、5-Fu、DDP在HepG2中的48h ICso与A组比有明显的升高,分别为A组的2.02倍(P<0.01),1.53倍(P<0.01),1.90倍(P<0.01)。结论缺氧微环境下AEG-1、MDR1在肝癌HepG2细胞株中呈高表达,高表达的AEG-1可能通过上调MDR1的表达,参与介导了肿瘤的多药耐药。第三章AEG-1基因RNAi质粒载体的构建、鉴定与筛选目的构建AEG-1基因RNAi质粒载体,筛选出阳性干扰质粒及阴性干扰对照质粒方法(1)设计靶序列并合成shRNA,构建干扰质粒载体pGPU6-AEG-1-shRNA。其中pGPU6-AEG-1-shRNA-NC为阴性干扰质粒,pGPU6-AEG-1-shRNA-746、pGPU6-AEG-1-shRNA-1490、 pGPU6-AEG-1-shRNA-1576为阳性干扰质粒。(2)酶切、测序鉴定质粒载体。(3)Lip2000介导下转染HepG2细胞,缺氧下培养48h。(4)检测转染率。分为四组：A组AEG-1-shRNA-NC; B组AEG-1-shRNA-746; C组AEG-1-shRNA-1490; D组AEG-1-shRNA-1576。(5) qRT-PCR、Western blotting检测各质粒转染肝癌HepG2细胞株中AEG-1mRNA和蛋白表达量。分为五组：A组HepG2+CoCl2; B组HepG2+CoCl2+shRNA-NC; C组HepG2+CoCl2+shRNA-746; D组HepG2+CoCl2+shRNA-1490; E组HepG2+CoCl2+shRNA-1576。结果(1)经酶切、测序鉴定,成功构建干扰质粒载体。(2)检测各质粒转染肝癌HepG2细胞株转染率,均达到75%左右,且各组间差异无统计学意义。(3) qRT-PCR、Western blotting方法检测结果显示,C组HepG2肝癌细胞株中的AEG-1mRNA和蛋白表达量较其他各组中要低,差异具有显著性(P<0.01),而B组细胞中AEG-1mRNA和蛋白表达量与A组无明显差别,差异无统计学意义。结论1.成功构建pGPU6-AEG-1-shRNA质粒载体。2.对靶基因AEG-1干扰效果较好的是pGPU6-AEG-1-shRNA-746质粒载体；而pGPU6-AEG-1-shRNA-NC对HepG2细胞中AEG-1的表达几无影响。第四章缺氧微环境下RNAi抑制AEG-1表达对HepG2多药耐药的影响目的探讨缺氧微环境下RNAi抑制AEG-1表达对HepG2多药耐药的影响方法(2)有效干扰质粒pGPU6AEG-1RNAi+和无效对照组质粒pGPU6AEG-1RNAi-转染HepG2肝癌细胞。(2)分为空白对照组(A组：HepG2+CoCl2)、阴性干扰组(B组：HepG2AEG-1-RNAi-+CoCl2)、阳性干扰组(C组：HepG2AEG-1-RNAi++CoCl2)(3) qRT-PCR、Western blotting检测各组肝癌HepG2细胞株中AEG-1、MDR1mRNA和蛋白Oh、24h、48h表达量。(4)MTT法检测ADM.5-Fu、DDP在各组细胞中的48h ICso°结果(1) qRT-PCR方法检测结果显示,C组HepG2肝癌细胞株中的AEG-1、MDR1mRNA表达量明显低于A、B组中的表达,差异有显著性(P<0.01)；A、B两组中的表达差异无统计学意义。(2) Western blotting检测结果显示,C组HepG2肝癌细胞株中的AEG-1、MDR1mRNA表达量明显低于A、B组中的表达,差异有显著性(P<0.01)；A、B两组中的表达差异无统计学意义。(3)MTT法检测结果显示,缺氧微环境下ADM、5-Fu、DDP在C组HepG2中的48h IC50和A组比较有明显的降低,分别为A组的0.59倍(P<0.01),0.69倍(P<0.01),0.66倍(P<0.01)。A、B两组比较无统计学意义。结论(1)缺氧微环境下特异性抑制HepG2中AEG-1的表达,可显著下调MDR1的表达,提示AEG-1作为MDR1的上游基因,可以上调MDRl的表达。(2)缺氧微环境下特异性抑制HepG2中AEG-1的表达,ADM、5-Fu、DDP在肝癌HepG2细胞中的IC50下降,提示抑制AEG-1表达一定程度逆转缺氧微环境下肝癌HepG2细胞的多药耐药性。