【摘 要】
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目的:本研究通过建立iPSCs向内皮分化模型,探讨HDACs在内皮分化过程中的表达变化,以及初步了解HDAC抑制剂对于内皮分化的影响,优化内皮诱导策略。方法:1.本研究首先使用CHIR99012将iPSCs诱导至中胚层,再通过VEGF、BMP4、FGF2三种生长因子将中胚层细胞向血管母细胞诱导,最后在VEGF的继续诱导下得到成熟内皮细胞。Real-time PCR和免疫荧光检测内皮标志CD31、C
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目的:本研究通过建立iPSCs向内皮分化模型,探讨HDACs在内皮分化过程中的表达变化,以及初步了解HDAC抑制剂对于内皮分化的影响,优化内皮诱导策略。方法:1.本研究首先使用CHIR99012将iPSCs诱导至中胚层,再通过VEGF、BMP4、FGF2三种生长因子将中胚层细胞向血管母细胞诱导,最后在VEGF的继续诱导下得到成熟内皮细胞。Real-time PCR和免疫荧光检测内皮标志CD31、CD144、v WF、KDR在诱导分化各阶段的表达谱,细胞成管实验和Dil-ac-LDL摄取实验验证内皮细胞的功能。2.以本研究内皮诱导分化体系为模型,收集分化各阶段细胞,real-time PCR和western blot检测HDAC1～8在内皮诱导分化过程中的动态表达变化。3.在诱导第二阶段,分别在培养体系中添加FGF2、BMP4、VEGF、FGF2+BMP4、FGF2+VEGF、BMP4+VEGF以及FGF2+BMP4+VEGF,收集各组细胞后real-time PCR检测FGF2、BMP4、VEGF单独或联合对早期内皮分化KDR、部分HDAC分子以及转录因子GATA4和MEF2C的影响。4.在诱导第二阶段、第三阶段分别用1μM和2μM的Na Bt处理,real-time PCR以及免疫荧光检测CD31和CD144、ACTA2的表达。结果:1.8d时,四种标志物表达量相比0d均有显著升高。在分化第10天,大部分细胞都表达CD31。同时细胞成管实验和Dil-ac-LDL摄取实验阳性,证明该体系诱导的内皮较为成熟且具有功能性。2.部分HDAC分子的表达量在4d时最高,而在总体上则呈现“降低-升高-降低-升高”的波动变化,以HDAC5的阶段性变化最为显著。3.FGF2、BMP4、VEGF三因子联用时对KDR的上调最显著,同时三因子联合处理可以促进内皮分化早期HDAC5的表达。4.第二阶段添加Na Bt后,CD31和CD144较对照组表达下调,而ACTA2表达上调。Na Bt在第三阶段则促进CD31和CD144表达,抑制ACTA2表达。结论:HDAC5在iPSCs内皮分化过程中呈现“降低-升高-降低-升高”的波动变化,在内皮分化中可被FGF2、BMP4和VEGF诱导。Na Bt第二阶段抑制、第三阶段促进内皮分化。
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