背景与目的:肿瘤是有机体在各种致癌因素作用下细胞异常增殖形成的新生物,目前其治疗主要以手术、放化疗为主,然而肿瘤的放化疗在杀伤肿瘤细胞的同时,往往也会将正常细胞一同杀灭,并带来诸如免疫力低下、放射性皮炎等一系列副作用。近年来,针对肿瘤血管内皮细胞的抗血管生成治疗,具有低耐药性、低不良反应等优点,逐渐发展为肿瘤的“第四治疗模式”。1971年Folkman提出了肿瘤生长和转移依赖血管生成,阻断血管生成是遏制肿瘤生长的有效策略这一学说。在原发性实体瘤的恶性生长和转移中,肿瘤血管生成起着关键的作用,把肿瘤新生血管作为靶点,通过抗血管生成来治疗肿瘤及其转移已成为近年来基础与临床研究的热点。肿瘤细胞生物学行为的复杂性决定了血管生成的复杂性,不同肿瘤或同一肿瘤在不同的生长时期,存在不同血管生成微环境,因此肿瘤血管生成的各个环节均可作为抗血管生成的作用靶点。而目前抗血管生成治疗针对的靶点单一,因此在肿瘤进展的不同时期,决定了针对单一靶点的药物不能自始至终发挥作用;鉴于肿瘤抗血管生成治疗的现状,本课题提出开发针对多个肿瘤血管生成环节为靶点的、同时作用于肿瘤血管内皮细胞和肿瘤细胞的抗血管生成药物。血管内皮生长因子(VEGF)是目前抗血管生成治疗最重要的靶点之一,在肿瘤血管形成过程中发挥着关键作用。研究发现肝素(Heparin)能够抑制VEGF和FGFs刺激血管内皮细胞增殖和血管的形成,以及影响纤维蛋白凝集的结构,改变纤溶酶原激活物的敏感性。因此,肝素可以作为VEGF的拮抗剂。整合素αvβ3也是目前抗肿瘤血管生成治疗的重要靶点之一,其在多种肿瘤细胞表面和新生血管内皮细胞中高表达,对肿瘤血管生成起着重要作用。研究显示,RGD肽能够竞争性地与肿瘤表面的受体整合素结合,阻止肿瘤细胞与基质之间的黏附,拮抗肿瘤血管生成,引起肿瘤细胞的凋亡,从而能够抑制肿瘤的生长和迁移,因此,RGD肽能够作为αvβ3的抑制剂应用于抗肿瘤血管生成的治疗。研究发现,叶酸受体(FR)在多种肿瘤(如乳腺癌、卵巢癌)表面高表达,而在正常组织表面不表达或低表达,具有良好的肿瘤组织特异性。叶酸受体与其配体叶酸的结合具有高度特异性,叶酸分子量相对小、易于修饰、免疫原性低,可作为靶向肿瘤细胞的理想配体,在肿瘤治疗领域应用广泛。生物素(Biotin)是酶的辅助因子,能够参与机体碳水化合物、脂类、蛋白质和核酸的代谢,生物素易与抗体结合,与抗生物素蛋白亲和素特异结合形成的生物素-亲和素系统具有多级放大效应,可广泛地用于抗原、抗体的定量检测等方面,因此生物素在生物医学领域的作用不容忽视。目前抗血管生成药物的进药方式主要是静脉注射,然而由于抗血管生成药物大多是普通剂型,在血液中容易受到各种酶类的降解,使得到达有效部位药物浓度降低,导致出现生物利用率下降、治疗效果不理想等情况。研究发现,以生物大分子为载体的自组装纳米药物具有良好的生物相容性、表面易于修饰等特点,在肿瘤组织具有高通透性和滞留性(EPR效应),能够延长药物在体内的循环时间,逃避网状巨噬细胞的吞噬,增加药物利用率,目前这种自组装的纳米药物已广泛的应用于肿瘤的治疗和诊断领域。基于此,本课题首先以肝素(Heparin)为载体,通过化学方法偶联生物素(Biotin)、RGD肽构建抗血管生成药物肝素-生物素-RGD(HBR),体外实验初步证明其具有良好的抗肿瘤细胞增殖和抑制微管形成的作用,但并不能自组装形成纳米粒子,因此大大限制了其在体内的应用。我们课题组前期研究发现,叶酸对构建以肝素为载体的自组装纳米粒子具有很好的促进作用。因此,我们在抗血管生成药物肝素-生物素-RGD(HBR)的结构基础上进一步引入叶酸,合成多靶点抗血管生成纳米药物肝素-生物素-叶酸-RGD(HBFR),并筛选出优化的纳米剂型,以人脐静脉内皮细胞、叶酸受体高表达的卵巢癌细胞、叶酸受体低表达的肺癌细胞为实验对象,考察纳米药物体内体外抗血管生成、抑制肿瘤细胞增殖等作用,为开发安全、高效的抗血管生成药物应用于癌症研究,提供研究基础。材料与方法:1.药物的制备及理化性质鉴定按摩尔比称取一定量的丁二酸化肝素、乙二胺Biotin、氨基化叶酸、RGD肽以及催化剂量的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)、羟基琥珀酰亚胺(NHS)搅拌溶于二甲基亚砜(DMSO)中,如有需要加入Oregon green染料,室温下反应过夜。次日将反应物液体移入透析袋,透析48 h除去DMSO,分别制备出肝素-Biotin(HB)、肝素-RGD(HR)、肝素-Biotin-RGD(HBR)、肝素-Biotin-叶酸-RGD(HBFR);根据成分配比不同,制备出两种多靶点纳米药物 NP1 和 NP2。应用动态光散射仪(DLS)、透射电子显微镜(TEM)对上述制备出的粒子的结构进行表征。应用紫外分光光度计测定叶酸在366 nm的吸光度-浓度标准曲线,将定量的纳米药物溶于去离子水中,测定其在366 nm的吸光度,根据标准曲线计算出相应叶酸的含量;Quant*TagTM Biotin Kit试剂盒测定肝素衍生物的Biotin含量;CQBCA蛋白定量试剂盒(Invitrogen)测定连接在纳米粒表面的RGD含量。2.流式细胞仪定量分析细胞摄取纳米药物情况为定量分析细胞摄取纳米药物的能力,将人卵巢癌细胞A2780、人肺癌细胞A549和人脐静脉内皮细胞HUVEC分别接种到6孔板,孵箱培养12h后,加入等量Oregon green绿色荧光标记的不同配比的纳米药物,严格避光,孵箱培养4 h后,流式细胞仪定量分析以上三种细胞对不同配比的纳米药物的摄取情况。3.MTT法测定药物的细胞毒性效应将 HB、HR、HBR、NP1 和 NP2 以两个药物浓度 0.8 mg/mL 和 0.6 mg/mL分别作用于人卵巢癌细胞A2780、人肺癌细胞A549和人脐静脉内皮细胞HU VEC 48 h后,利用MTT法测定各组细胞的相对存活率并计算半数抑制浓度。4.Transwell 实验为检测多靶点纳米药物抑制细胞迁移的能力,以卵巢癌细胞A2780、肺癌细胞A549和人脐静脉内皮细胞HUVEC为实验对象,设空白对照组、阳性对照组及纳米药物组,将细胞接种到Transwell小室内,孵箱培养12-24 h,观察细胞穿膜情况,当镜下看到10个左右的细胞时,终止培养,甲醇固定,苏木素染色,切膜,制片,于正置显微镜下拍照计数并统计空白对照组及纳米药物组之间穿膜细胞数的差异,分析相对迁移率并统计P值。5.微管形成实验为检测抗血管生成药物(HBR)和多靶点纳米药物(HBFR)对人脐静脉内皮细胞HUVEC微管形成的抑制能力,以人脐静脉内皮细胞HUVEC为作用对象,设置空白对照组、阳性对照组和药物组,将稀释好的ECMatrix溶液加入到预冷的96孔板中,孵箱培养1 h,使胶固化,将含细胞的培养液稀释纳米药物分别加入96孔板中,孵箱培育7-14 h后,倒置光学显微镜下观察三组血管形成情况,计算管腔形成抑制率(计算公式为:抑制率(%)=(Tube length control-Tube length sample)/Tube lengthcontrol×100%),分析三组之间差异有无统计学意义。6.基质胶栓实验为检测多靶点纳米药物体内抑制新生血管生成的能力,以裸鼠为实验对象,设空白对照组、低分子量肝素组(LMWH)和纳米药物组,三组均加入低生长因子基质胶与b-FGF的混合液,再分别加入PBS、LMWH和纳米药物,总体积为700 μL。将配好的混合液注射到裸鼠的两侧腹部血管密集处,每组3只裸鼠,7天后,处死裸鼠,取出基质胶栓,行免疫组化实验,光学显微镜下观察并比较三组血管的生成情况有无差异。7.裸鼠皮下成瘤实验为检测多靶点纳米药物在体内对肿瘤细胞生长及肿瘤新生血管形成的抑制作用,以裸鼠为实验对象,设空白对照组、LMWH对照组和纳米药物组,每组3只裸鼠。选取对数期生长、状态良好的卵巢癌细胞A2780随机接种于9只裸鼠后背部皮下,接种细胞数为5×105。细胞接种4-5天肉眼可见皮下肿瘤形成后,每隔1天用游标卡尺测量肿瘤的长短径,按以下公式计算肿瘤体积:v=1/2×a×b2(v代表肿瘤的体积大小,a代表肿瘤的最长径,b代表肿瘤的最短径)。毎次测量完成后予以尾静脉注射给药,空白组注射PBS,LMWH对照组和纳米药物组分别注射LMWH和纳米药物,给药浓度均为90 U/mL。2周后将裸鼠处死,取出肿瘤组织,拍照,固定,包埋,切片,行免疫组化实验,正置光学显微镜下观察并比较三组血管的生成情况。8.免疫组化实验为进一步分析多靶点纳米药物体内抑制肿瘤新生血管生成的能力,将基质胶栓组织和裸鼠皮下成瘤组织行免疫组化进行血管标记抗体CD34染色,经固定、石蜡包埋、脱蜡、抗原修复、阻断内源性过氧化物酶、血清封闭、抗体孵育、DAB显色、复染、透明、封片等步骤后,正置光学显微镜下观察染色情况并比较三组血管标记抗体CD34表达情况有无差异。9.统计学分析采用SPSS13.0统计分析软件进行统计学分析,所有数据均以x+s表示。HB、HR和HBR,HBR、NP1和NP2的细胞毒性作用比较采用One-WayANOVA,LMWH、NP1和NP2抑制细胞迁移作用的比较采用One-Way ANOVA;LMWH、NP1和NP2抑制微管形成能力的比较采用One-Way ANOVA;LMWH、NP1抑制体内血管形成作用的比较采用两独立样本t检验;差异性检验水准设为P<0.05(双侧)。结果:1.药物的制备及理化性质鉴定我们将肝素、Biotin和RGD通过化学方法进行偶联合成抗血管生成药物(HBR),动态光散射仪显示其在水中有较大的粒径,并且分散系数很大,说明其在水中并不能自组装形成纳米粒子。在抗血管生成药物(HBR)的结构基础上,我们引入叶酸,将肝素、Biotin、叶酸和RGD通过化学方法进行偶联,在水中自组装形成纳米粒子,根据成分配比不同制备得到两种多靶点纳米药物:NP1和NP2。透射电子显微镜下观察到纳米药物呈均匀分布的球形状态,动态光散射仪显示两种纳米药物的粒径分别为25±4.1 nm和30±4.3 nm,电位分别为-25±5.9 mv和-28±5.5 mv,分散系数分别为0.201和0.257。紫外光谱方法测得叶酸含量分别为8.7%和6.3%,Quant*Tag TM Biotin Kit 试剂盒测定 Biotin 含量分别 1.6%和 1.3%,CQBCA 蛋白定量试剂盒测定RGD含量分别为11.2%和9.38%。2.流式细胞仪定量分析细胞摄取情况:流式结果显示,与空白对照组相比,卵巢癌细胞A2780、肺癌细胞A549和人脐静脉内皮细胞HUVEC三种细胞内纳米药物的荧光强度明显增加,且NP1组的荧光强度略强于NP2组;说明上述三种细胞对纳米药物具有良好的摄取能力。3.MTT法检测合成的药物对细胞的毒性效应经HB、HR、HBR分别作用48h后,卵巢癌细胞A2780和人脐静脉内皮细胞HUVEC的相对存活率依次为HR