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目的:旨在通过检测T-钙粘蛋白(T-cadherin)和P-钙粘蛋白(P-cadherin)在寻常型银屑病(Psoriasis vulgaris,PV)患者皮损组织和正常表皮组织中表达的差异性,分析其在PV患者皮损组织中的表达与PV患者临床资料之间的关系,以及它们在PV患者皮损组织中表达的相关性,探讨银屑病的病因及发病机制。
方法:利用SP免疫组织化学法检测38例PV患者皮损组织和15例正常表皮组织中T-cadherin和P-cadherin的表达水平。
①PV患者皮损标本的取材:常规消毒,局部浸润麻醉,选择未经治疗的,成熟的皮损,用手术刀沿皮纹方向作0.5cm×1cm的梭形切口,切忌钳取所取组织。
②固定:切下的组织立即放入4%多聚甲醛溶液的小瓶中固定,固定至少30s后修成厚度不超过1.5mm的组织块标本。
③脱水和浸蜡:固定好的标本放入丙酮液中3~4次,每次3~8min脱水,脱好水的标本放入已熔化的石蜡中3~5min。按要求包埋和修整蜡块。
④常规4 μm连续切片,黏附于多聚赖氨酸溶液(Poly-L-Lysine Solution)处理后的玻片上,切片常规脱蜡水化后,将切片放入0.01m枸橼酸钠缓冲溶液(pH6.0),置于高压锅(工作压力为90 KPa/cm2),电炉加热至沸腾5 min,取出切片冷却。
⑤清水冲洗5 min后进入新鲜配制的3%H2O2甲醇液,室温10 min,以灭活内源性过氧化物酶活性。滴加10%正常马血清封闭液,室温20 min后甩去多余液体,勿洗;
⑥滴加相应一抗,37℃,孵育1 h,PBS冲洗,3min×3次;滴加相应生物素标记二抗,37℃,孵育20 min,PBS冲洗,3 min×3次;
⑦滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液,37℃孵育10~30分钟;PBS冲洗,3 min×3次;
⑧DAB显色,室温下,镜下控制显色时间2 min;苏木素复染,常规脱水,透明,封片。
⑨以胞膜或细胞间出现棕黄色颗粒为阳性细胞,按每张切片的阳性细胞比例及着色深浅划分-、+、++、+++四级,基本不着色或着色细胞少于5%为阴性(-);着色浅淡或着色细胞占5%~25%为弱阳性(+);着色适中或着色细胞占26%~50%为中度阳性(++);着色深或着色细胞大于50%为强阳性(+++)。
⑩所有病例数据均以统一的调查表进行收集,用SPSS 12.0系统软件进行分析。两个样本率之间的差异用X2检验,等级资料的两样本比较用Wilcoxon秩和检验,皮损处T-cadherin和P-cadherin水平的比较采用Kendalls tau-b等级相关分析。P<0.05有统计学意义,P<0.01有显著统计学意义。
结果:
1.T-cadherin在PV皮损组织和正常表皮组织中的阳性表达率分别为26.31%、100.00%,二者比较有显著统计学意义(X2检验P<0.01);
2.P-cadherin在PV皮损组织和正常表皮组织中的阳性表达率分别为78.95%、15.38%,二者比较有显著统计学意义(X2检验P<0.01);
3.T-cadherin在PV皮损组织中的表达与患者的性别、年龄无关,与患者的瘙痒感及病程的分期无关,但与家族史有关,T-cadherin在有家族史PV皮损中的表达强度低于无家族史PV,有统计学意义(秩和检验P<0.05);
4.P-cadherin在PV皮损组织中的表达与患者的性别、年龄无关,与患者的瘙痒感及有无家族史也无关,但与病程的分期有关,P-cadherin在进行期PV皮损中的表达强度高于稳定期PV和消退期PV,有统计学意义(秩和检验P<0.05);
5.T-cadherin和P-cadherin在PV患者皮损组织中的表达呈显著负相关 (Kendalls tau-b等级相关分析tau-b=0.461,P<0.01)。
结论:
1.T-cadherin在PV患者皮损组织中的表达水平明显低于正常表皮组织,提示T-cadherin可能在PV的发病机制中发挥重要作用;
2.P-cadherin在PV患者皮损组织中的表达水平明显高于正常表皮组织,提示P-cadherin的异常表达与其角质形成细胞过度增殖有关;
3.T-cadherin在PV皮损组织中的表达与患者的性别、年龄无关,与患者的瘙痒感及病程的分期无关,但与家族史有关,T-cadherin在有家族史PV皮损中的表达强度低于无家族史PV,有统计学意义(秩和检验P<0.05),提示家族遗传背景可能是银屑病易感性因素;
4.P-cadherin在PV皮损组织中的表达与患者的性别、年龄无关,与患者的瘙痒感及有无家族史也无关,但与病程的分期有关,P-cadherin在进行期PV皮损中的表达强度高于稳定期PV和消退期PV,有统计学意义(秩和检验P<0.05),可能与进展期PV凋亡受抑制,增殖更活跃有关,标志着表皮增殖动力学紊乱;
5.T-cadherin和P-cadherin在PV患者皮损组织中的表达呈显著负相关,提示两者可能存在着一定的内在联系。两者共同的表达结果导致角质形成细胞(keratinocyte,KC)异常增生。