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[研究背景]神经病理性疼痛是神经系统损伤引起的一种慢性状态,严重困扰人类的健康。背根神经节(dorsal root ganglia, DRG)作为痛觉传入的第一级神经元,在神经病理性疼痛的外周机制中起着重要作用。目前有研究表明细胞骨架及其相关蛋白如膜联蛋白A2(annexinⅡ, annexin A2)和β5微管蛋白(tubulin beta-5/beta 5-tubulin)与DRG伤害性感受传导过程关系密切,但分子机制尚不明确。本实验利用基因工程的技术,提取大鼠DRG中annexinⅡ的基因Anxa2和tubulin beta-5的基因Tubb5,构建其真核表达载体,并对其在哺乳动物细胞中的表达作初步鉴定,以期为深入研究annexinⅡ和(?) tubulin beta-5在调控DRG伤害性感受传导过程中的分子机制及明确与其相互作用的蛋白奠定基础。[研究目的]克隆大鼠背根神经节annexinⅡ和tubulin beta-5的基因,构建真核表达载体并检测其表达。[研究方法]提取大鼠腰部背根神经节组织总RNA, RT-PCR法扩增大鼠DRG细胞中annexinⅡ的基因Anxa2和tubulin beta-5的基因Tubb5,分别构建pGMT-Anxa2和pGMT-Tubb5克隆载体。以此为模板,设计含有flag标签序列的引物序列,上下游分别插入HindⅢ、NotⅠ酶切位点,PCR扩增Anxa2-flag和Tubb5-flag序列,并与pcDNA3.1(+)空载体行连接转化Top10感受态细胞,在Amp琼脂平板上挑选克隆。抽提质粒后行PCR及酶切鉴定,鉴定为阳性克隆者用T7、BGH引物对其进行全序列测定分析。从而获得表达载体pcDNA3.1 (+)-Anxa2-flag和pcDNA3.1 (+)-Tubb5-flag o采用Lipo2000脂质体法将表达载体转染到六孔板培养的HEK293细胞中,设表达载体组、pcDNA3.1(+)空载体对照组和空转HEK293细胞的阴性对照组。细胞免疫荧光检测需事先制成细胞爬片,转染48小时后分别以小鼠源性anti-flag抗体(1:200). FITC标记的山羊抗小鼠IgG(1：200)孵育,DAPI染核、封片后于倒置荧光显微镜下观察结果并照相。FITC激发后可产生绿色荧光,指示目的蛋白annexinⅡ或tubulin beta-5的分布；DAPI激发后可产生蓝色荧光,指示细胞核的分布。六孔板(未置爬片)细胞转染48-72小时后,收集细胞提取蛋白。以小鼠源性anti-flag抗体为一抗(1：500)、辣根过氧化物标记的IgG-HRP为二抗(1：5000)行Western blot法检测。[结果]1.PCR扩增Anxa2/Tubb5的mRNA编码序列：Anxa2和Tubb5大小分别为1020bp和1335bp。行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定,结果可见Anxa2样品条带约为1000bp左右,Tubb5样品条带约为1300bp左右,与预期结果相同,PCR扩增成功。2. pGMT-Anxa2/pGMT-Tubb5克隆载体鉴定：pGMT-Anxa2/pGMT-Tubb5质粒样品行1%琼脂糖凝胶电泳后紫外灯下观看均有亮带,示有质粒提出；选取最亮条带的质粒样品行序列测定,结果示克隆载体pGMT-Anxa2/pGMT-Tubb5构建正确。3.PCR扩增出Anxa2-flag和Tubb5-flag片段：Anxa2-flag和Tubb5-flag的大小分别为1044bp和1359bp。行1%琼脂糖凝胶电泳,可见Anxa2-flag条带在1000-1100bp之间,Tubb5-flag条带在1300-1400bp之间,与预期结果相同,PCR扩增成功。4.重组质粒的鉴定：以重组质粒pcDNA3.1(+)-Anxa2-flag和pcDNA3.1(+)-Tubb5-flag为模板行PCR,产生约为1044bp和1359bp的条带；质粒经HindⅢ和Not I双酶切鉴定,可分别切开约为1044bp和1359bp的小片段；酶切鉴定正确者行序列测定,结果示重组质粒pcDNA3.1 (+)-Anxa2-flag和pcDN A3.1 (+)-Tubb5-flag构建成功。5.细胞免疫荧光检测目的蛋白及细胞内定位：pcDN A3.1 (+)-Anxa2-flag组FITC激发后产生绿色荧光,指示目的蛋白annexinⅡ有稳定表达,并且广泛均匀分布于胞质和胞膜；pcDNA3.1(+)-Tubb5-flag组,FITC激发后亦有绿色荧光,广泛分布于胞质和胞膜,指示目的蛋白tubulin beta-5表达。两组实验中转染pcDNA3.1(+)空载体组和阴性对照组的HEK293细胞内均未检测到标记目的蛋白荧光信号。6. Western blot法检测annexinⅡ蛋白和tubulin beta-5蛋白的表达：pCDNA3.1(+)-Anxa2-flag和pCDNA3.1(+)-Tubb5-flag表达载体组分别在相对分子质量约为36KD、50KD处出现单一蛋白条带,pcDNA3.1(+)空载体对照组和阴性对照组无特异条带出现,且内参β-actin表达较均一。[结论]成功构建pcDNA3.1(+)-Anxa2-flag和pcDNA3.1(+)-Tubb5-flag真核表达载体,并在体外稳定表达蛋白,为研究annexinⅡ和tubulin beta-5调控DRG伤害性感受传导的分子机制奠定基础,为进一步探讨神经病理性疼痛的预防和治疗方法提供新的思路。