【摘 要】
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目的:本研究主要明确ATP13a3在力学载荷作用下MC3T3-E1前成骨细胞系的表达差异,分析力学载荷作用下ATP13a3对MC3T3-E1细胞系成骨分化的影响;探讨力学响应基因ATP13a3调节成骨分化的作用机制。方法:1.通过荧光定量PCR检测MC3T3-E1细胞在2500με、0.5Hz持续8h的力学载荷和非力学载荷作用下ATP13a3的表达情况。2.构建ATP13a3的过表达载体和筛选AT
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目的:本研究主要明确ATP13a3在力学载荷作用下MC3T3-E1前成骨细胞系的表达差异,分析力学载荷作用下ATP13a3对MC3T3-E1细胞系成骨分化的影响;探讨力学响应基因ATP13a3调节成骨分化的作用机制。方法:1.通过荧光定量PCR检测MC3T3-E1细胞在2500με、0.5Hz持续8h的力学载荷和非力学载荷作用下ATP13a3的表达情况。2.构建ATP13a3的过表达载体和筛选ATP13a3的最佳小干扰RNA。3.分别应用小干扰RNA和过表载体对MC3T3-E1细胞进行瞬时转染,使ATP13a3表达下调或上调,转染48h后给予力学载荷刺激。4通过检测碱性磷酸酶活性,成骨分化标志基因和成骨分化标志蛋白的表达,探讨ATP13a3对成骨分化的影响。5.为了研究ATP13a3调节成骨分化的作用机制,对力学载荷组和力学载荷转染ATP13a3小干扰RNA组进行转录组测序。生物信息学及荧光定量PCR确定ATP13a3在力学载荷调节成骨分化过程中的作用机制。结果:1.力学载荷作用下,MC3T3-E1细胞ATP13a3 mRNA表达下调。2.MC3T3-E1细胞在力学载荷和ATP13a3下调的情况下,其上清液碱性磷酸酶活性上调,成骨分化基因Col1、OCN、ALP表达增加,成骨分化蛋白Col1、BMP2、Runx2蛋白表达均增加。MC3T3-E1细胞在力学载荷和ATP13a3上调情况下,其上清液碱性磷酸酶活性无差异,成骨分化标志基因Col1、OCN、ALP表达无明显变化,成骨分化标志蛋白BMP2蛋白表达也无明显变化。3.将MC3T3-E1细胞力学载荷组和力学载荷转染ATP13a3小干扰RNA组进行转录组测序,生物信息学分析ATP13a3主要通过TNF信号通路促进成骨分化,其关键的下游靶基因可能是Il6。4.MC3T3-E1细胞力学载荷并转染ATP13a3小干扰RNA组与MC3T3-E1细胞力学载荷组相比,荧光定量PCR验证ATP13a3下游基因Tnf、Tnfr2、Jun、Nfkb1、Traf1均上调。结论:ATP13a3是力学响应基因。力学响应基因ATP13a3在低表达时促进MC3T3-E1细胞成骨分化。力学载荷作用下低表达ATP13a3促进成骨分化是通过激活TNF信号通路来实现的。ATP13a3下游靶基因可能是Tnf、Tnfr2、c-Jun、Nfkb1、Traf1。
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