第一部分:芪葵颗粒对糖尿病肾病患者临床疗效研究目的 通过芪葵颗粒对糖尿病肾病患者进行治疗,确认芪葵颗粒临床疗效,为后续研究提供临床数据支持。方法 筛选2016年3月～2020年1月在我院确诊为2型糖尿病的患者作为研究对象,所有患者均符合2型糖尿病诊断且病史资料完整、临床样本收集齐全。通过尿白蛋白排泄率及临床信息诊断分为糖尿病组及糖尿病肾病组。糖尿病组采用常规降糖治疗,作为对照组。糖尿病肾病组采用常规降糖治疗,并口服芪葵颗粒治疗,作为治疗组。治疗前后,采集治疗组患者血液样本及尿液样本。对比糖尿病组、糖尿病肾病组治疗前后的性别、年龄、收缩压、舒张压、高血压发病率、FPG、HBA1c、TG、PBG、TC、血肌酐（SCR）、UACR、24h-UTP 及 EGFR 等指标。结果 两组患者治疗前一般资料:男女比例、年龄、收缩压、舒张压、高血压发病率等比较,差异均无统计学差异（P<0.05）。与糖尿病组（DM组）对比,DN组患者的FPG、HBA1c及TG显著高于DM组,差异具有统计学意义（P<0.05）;两组患者PBG、TC水平无显著性差异（P>0.05）。与糖尿病组（DM组）对比,DN组患者的血肌酐（SCR）、UACR、24h-UTP水平均显著高于DM组,EGFR水平显著低于DM组,差异具有显著统计学意义（P<0.01）。与治疗前对比,治疗后DN组患者的UACR、24h-UTP 水平均显著降低,差异具有显著统计学意义（P<0.01）。SCR略为升高,而EGFR略为降低,但与治疗前相比,无显著性差异（P>0.05）。与表3数据进行比较,可以发现DN组虽经治疗后UACR、24h-UTP均有所改善,SCR和EGFR略微改善,但与DM组相比,仍有显著性差异（P<0.01）。结论 芪葵颗粒可改善糖尿病肾病患者SCR、UACR、24h-UTP及EGFR功能治疗,对糖尿病肾病具有临床治疗作用。后续对芪葵颗粒有效成分金丝桃苷进行药理学研究具有临床支持。第二部分:金丝桃苷通过miR-499-5p/NRIPI对高糖干预的HK-2细胞的保护作用及机制目的:通过观察金丝桃苷对高糖诱导的HK-2细胞影响,探讨金丝桃苷对高糖干预的HK-2细胞凋亡和炎症反应的影响及相关机制。方法:HK-2细胞株作为正常肾小管细胞的模型,在高糖条件（含45.0 mmol/L葡萄糖培养基）中进行培养,以建立体外糖尿病肾病模型。TUNEL法检测细胞凋亡,流式细胞仪检测细胞凋亡。用ELISA试剂盒检测炎症反应。Western blotting检测凋亡相关基因和炎性细胞因子的蛋白水平。机制分析包括荧光素酶报告实验和RNA pulldown实验来检测分子间的结合关系。结果:首先,分别通过CCK-8、TUNEL及流式细胞术测定对照组（Control）、高糖模型组（HG）、治疗组（HG+Hyperoside）条件下HK-2细胞的存活情况。数据表明,高糖处理可诱导细胞凋亡,金丝桃苷可减少细胞凋亡且具有剂量依赖性。Western blot分析显示,金丝桃苷可使HG诱导的Bax表达增加和Bcl-2表达降低。检测HG处理的HK-2细胞中IL-10、IL-6和IL-1β的蛋白水平。HG可上调IL-6、IL-1β蛋白水平,下调IL-10蛋白水平,金丝桃苷可拮抗HG对IL-10、IL-6、IL-1β的影响。用ELISA试剂盒检测这些促炎细胞因子的浓度。结果表明,金丝桃苷逆转了 HG对HK-2细胞炎症反应的刺激作用。接下来,我们发现在HK-2细胞中miR-499-5p被HG下调,并进一步被金丝桃苷剂量依赖性上调。RT-qPCR检测miR-4995p对HG处理的HK-2细胞的基因敲除效应。miR-4995p的表达被miR-499-5p抑制剂有效地下调。miR-499-5p抑制剂可挽救金丝桃苷对HG处理的HK-2细胞的抗凋亡作用。Western blot和ELISA结果表明,抑制miR-499-5p可挽救金丝桃苷诱导的HK-2细胞IL-10水平的升高,以及IL-6和IL-1β水平的降低。根据Starbase预测,NRIP1被确定为miR-499-5p的下游靶点。HG诱导HK-2细胞NRIP1表达上调,金丝桃苷处理呈剂量依赖性降低NRIP1的表达。miR-499-5p抑制剂促进HK-2细胞NRIP1 mRNA和蛋白水平,与HG处理无关。从Starbase预测了 miR-499-5p和NRIP1的结合序列。NRIP1的结合位点发生突变,用于下一步的荧光素酶报告分析。转染miR499-5p抑制剂增强了 HK-2细胞中pmirGLO-NRIP1-Wt质粒的荧光素酶活性,而对pmirGLO-NRIP1Mut质粒的荧光素酶活性没有显著影响。RNA Pulldown实验数据表明,与 bio-miR-499-5p Mut 相比,BIO-miR-499-5p Wt 下拉的产物中 NRIP1含量丰富,表明miR-499-5p与NRIP1存在相互作用。进行抢救试验显示,抑制NRIP1可以挽救miR-499-5p对HK-2细胞的促凋亡作用。沉默的miR-499-5p对IL-10、IL-6和IL-1β蛋白水平的刺激作用可通过下调NRIP1来恢复结论:金丝桃苷通过miR-499-5p/NRIP1轴减轻HG诱导的HK-2细胞凋亡和炎症反应。第三部分:金丝桃苷通过靶向miR-499-5p/APC轴改善STZ诱导的糖尿病肾病目的:本研究旨在进一步探讨金丝桃苷通过靶向miR-499-5p/APC轴改善STZ诱导的糖尿病肾病的作用机制。方法:HK-2细胞株作为正常肾小管细胞的模型,在高糖条件（含45.0 mmol/L葡萄糖培养基）中进行培养,以建立体外糖尿病肾病模型。TUNEL法检测细胞凋亡,流式细胞仪检测细胞凋亡。用ELISA试剂盒检测炎症反应。Western blotting检测凋亡相关基因和炎性细胞因子的蛋白水平。机制分析包括荧光素酶报告实验和RNA下拉实验来检测分子间的结合关系。采用SPF级C57BL/6雄性小鼠,高脂高糖饮食及STZ诱导建立糖尿病肾病小鼠模型。通过给予不同剂量金丝桃苷进行治疗,测定各剂量组小鼠尿蛋白和血糖、体重、收缩压、血肌酐和肾小球滤过率。用RT-qPCR检测miR-499-5p和APC水平,评价miR-499-5P和APC对小鼠血糖的影响。组织学免疫染色观察肾组织结构,测定PAS 阳性小鼠肾小球面积指数和系膜扩张指数,对小鼠肾小球和肾间质胶原沉积进行定量。用免疫印迹法检测各组Bax、Bcl-2、胶原Ⅰ、胶原Ⅳ和纤维连接蛋白的蛋白水平。用ELISA法检测各组细胞因子（肿瘤坏死因子-α、单核细胞趋化蛋白-1、白细胞介素-1-β）的含量。利用TargetScan（http://www.targetscan.org）)数据库来预测含有APC3‘非编码区结合位点的潜在miRNA。结果:用高糖（25 mmol/L）处理足细胞模拟细胞损伤,以正常葡萄糖（5.5mmol/L）作对照。高糖显著上调细胞外基质（包括胶原Ⅰ、胶原Ⅳ和纤维连接蛋白）的表达,金丝桃苷则抑制其升高。此外,在高糖环境下炎症细胞因子TNF-α、单核细胞趋化蛋白-1和IL-1β的蛋白水平升高。同时金丝桃苷可以降低高糖模型中炎症反应。金丝桃苷可拮抗HG诱导的足细胞Bax的升高、Bcl-2的降低、Caspase-3活性的降低。采用高脂饮食和链脲佐菌素（Streptozocin,STZ）注射诱导糖尿病肾病小鼠模型,糖尿病肾病小鼠血糖升高,然后用金丝桃苷或胰岛素治疗后降低。根据PAS和Masson‘s三色染色的结果,我们发现金丝桃苷治疗可以对抗STZ介导的肾小球面积和大小的增加。注射链脲佐菌素后,糖尿病大鼠肾小球表面积明显增加,肾小球系膜扩张,肾小管-肠系膜胶原大量积聚。然而,这种作用被金丝桃苷处理明显取消。Western blot分析发现,金丝桃苷治疗可减轻糖尿病肾病小鼠肾组织中细胞外基质（胶原Ⅰ、胶原Ⅳ和纤维连接蛋白）的积聚。此外,Western blot和ELISA分析表明,金丝桃苷治疗可以抑制STZ诱导的炎症反应。最后,与Sham+DMSO组相比,STZ介导的Bax的升高和Bcl-2蛋白水平的降低被Hyproside治疗所拮抗,与Sham+DMSO组相比,STZ介导了 Bax的升高和Bcl-2蛋白水平的降低。RT-qPCR分析表明,miR-499-5p在金丝桃苷处理的足细胞中比其他miRNAs显示更多的上调。然后,RT-qPCR发现miR-499-5p水平被高糖降低,然后通过体内金丝桃苷处理恢复。通过TargetScan推测了 miR-499-5P与APC的3’UTR之间的结合序列,通过转染miR-499-5p模拟物和抗miR-499-5p分别过表达和下调miR-499-5p的表达水平。用足细胞进行荧光素酶报告实验表明,野生型pGLO-APC-3’UTR的荧光素酶活性被异位miR-499-5p显著降低,而被miR-499-5p沉默的野生型pGLO-APC-3’UTR的荧光素酶活性显著升高,而突变体pGLOAPC-3’UTR的荧光素酶活性没有明显的变化。RT-qPCR和Western blot分析表明,miR-4995p扩增能提高mRNA和蛋白质水平,而miR-499-5p抑制能降低mRNA和蛋白质水平。最后,miR-499-5p抑制取消了金丝桃苷对足细胞APC mRNA水平的抑制作用。小鼠分别注射AA V-miR-499-5P和AA V-APC后,左肾组织miR-499-5p和APC水平显著升高,右肾无明显分化。miR-499-5p过表达和APC过表达对糖尿病肾病小鼠的血糖、体重、血肌酐和血压均无明显影响。miR-499-5p对GFR的抑制作用被APC过表达所抵消。与DN+Mock+载体组比较,AA vmir-499-5P组肾小球肥大程度减轻,肾小球表面积减少。这种影响被APC的过度表达所抵消。在糖尿病肾病小鼠中,通过AA V-APC治疗,miR-499-5P对肾小球表面积和系膜伸展的抑制作用以及肾小管间质胶原堆积的减少都得到了恢复。在糖尿病肾病小鼠中,miR-499-5P对肾小球表面积和系膜伸展的抑制作用以及肾小管间质胶原堆积的减少都得到了恢复。同样,Western blot分析表明,miR-499-5p导致的肾组织ECM减少也被APC过表达所抵消。此外,注射AA V-miR-499-5p可降低糖尿病肾病小鼠血清中炎症细胞因子的含量。然而,这一结果被APC的过度表达所抵消。AAV-miR-499-5p诱导的Bax降低和Bcl-2升高可被糖尿病肾病小鼠肾组织中APC的过表达所抵消。最后,miR-499-5p的过表达破坏了高糖处理对尿蛋白的促进作用,可被异位APC逆转。结论:金丝桃苷在体外可抑制HG诱导的ECM聚集、炎症反应和细胞凋亡。金丝桃苷治疗改善了 STZ诱导的小鼠的糖尿病症状,减轻了糖尿病肾病小鼠的肾脏损伤和纤维化。金丝桃苷在体外和体内均能抑制APC水平。而APC被miR499-5p直接靶向和负调控。miR-499-5P通过靶向APC减轻糖尿病肾病小鼠的肾功能障碍。APC的过表达逆转了miR-499-5p对肾脏损伤和纤维化的影响。