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第一部分植物乳杆菌来源的细胞外囊泡在缺血再灌注损伤中的作用研究目的:1.探讨植物乳杆菌来源的细胞外囊泡能否穿过血脑屏障,以及被体内外缺血神经元吸收;2.探索植物乳杆菌来源的细胞外囊泡在t MCAO/R小鼠模型中的功能作用;3.研究植物乳杆菌来源的细胞外囊泡在原代神经元OGD模型的功能作用。方法:1.将LEVs进行DiR标记后通过尾静脉注入C57小鼠,IVIS系统分别观察第6小时、12小时、18小时和24小时C57小鼠活体成像情况。将LEVs进行PHK26标记,然后通过尾静脉注入t MCAO/R模型中,以及与原代皮质神经元细胞共培养,使用免疫荧光染色方法检测神经元吸收情况。2.在tMCAO/R小鼠中通过尾静脉注射LEVs为实验组,注射PBS为对照组,通过m NSS评分评估神经功能缺损情况,使用TTC染色检测梗死情况,使用HE染色对小鼠皮质缺血半暗带进行病理学观察,Western blot技术检测细胞凋亡相关蛋白（Bax、Bcl-2、Total Caspase3和Cleaved Caspase3）的表达情况,TUNEL染色检测TUNEL+和TUNEL+Neu N+细胞率。3.分别用LEVs（实验组）或PBS（对照组）与原代神经元共培养24小时,然后进行OGD,使用CCK8检测各组神经元存活情况,LDH测定细胞活力,Western blot检测细胞凋亡相关蛋白的表达情况,TUNEL染色检测两组间TUNEL+细胞率。结果:1.IVIS系统分别观察到第6小时、12小时、18小时和24小时C57小鼠颅内有Di R标记的外囊泡。表明,C57小鼠尾静脉注射LEVs后,可穿过血脑屏障进入脑组织。免疫荧光检测结果提示,在大脑缺血皮质神经元和原代皮质神经元中均被观察到被PHK26标记的LEVs,表明LEVs能被体内外缺血神经元吸收。2.m NSS评分显示,与t MCAO/R+PBS治疗组相比较,t MCAO/R+LEVs治疗后明显减轻了卒中后3天的神经功能缺损LEVs（p＜0.05）。使用TTC染色检测t MCAO/R小鼠梗死情况,与t MCAO/R+PBS治疗组相比较,t MCAO/R+LEVs治疗后减了t MCAO/R 3天后的梗塞面积（p＜0.05）。使用HE染色对小鼠皮质缺血半暗带进行病理学观察。其结果显示,t MCAO/R+PBS治疗组皮质胶质细胞增生,细胞较前肿胀,神经元灶区可见轻度退变,神经毡疏松、软化较为明显,t MCAO/R+LEVs治疗组皮质胶质细胞轻度增生,细胞基本正常,仅在灶区神经毡疏松、软化。使用Western blot技术检测细胞凋亡相关蛋白的表达情况,与t MCAO/R+PBS治疗组相比,LEVs治疗组中Bax和Cleaved Caspase3蛋白表达减少,而Bcl-2蛋白表达增加（p＜0.05）。使用TUNEL染色检测TUNEL+和TUNEL+Neu N+细胞率,OGD+LEVs治疗组TUNEL+和TUNEL+Neu N+细胞率与PBS治疗组比降低（p＜0.05）。3.使用CCK8检测各组神经元存活情况,LEVs治疗后明显增加了OGD后神经元的活力（p＜0.05）。OGD后使细胞损伤增加了5倍,但使用LEVs治疗后使细胞死亡减少到对照组的2倍。使用Western blot检测细胞凋亡相关蛋白的表达情况,OGD+LEVs治疗组中Bax和Cleaved caspase-3蛋白的表达量较OGD+PBS治疗组明显降低,Bcl-2蛋白的表达量较PBS治疗组增加（p＜0.05）。TUNEL染色检测两组间TUNEL+细胞率,LEVs治疗组TUNEL+细胞率与OGD+PBS治疗组比显著降低（p＜0.05）。结论:1.LEVs可穿过血脑屏障,在体外和体内均被神经元吸收。2.LEVs治疗后显著减少t MCAO/R小鼠模型神经功能损伤和脑梗死面积。3.LEVs治疗减弱了氧-葡萄糖剥夺（OGD）后的神经元凋亡。第二部分植物乳杆菌来源的细胞外囊泡通过miR-101a-3p调控c-Fos/TGF-β1通路影响缺血性脑卒中后神经元凋亡的研究目的:1.探索PBS和LEVs治疗原代神经元OGD/R模型差异表达的miRNA;2.明确LEVs通过改变缺血模型差异表达最明显的miRNA（miR-101a-3p）及其下游靶蛋白;3.探讨miR-101a-3p能否调控t MCAO/R小鼠模型的神经功能;4.研究miR-101a-3p是否能调控c-Fos/TGF-β1信号通路;5.探索miR-101a-3p能否调控t MCAO/R小鼠的神经元凋亡;6.研究miR-101a-3p能否通过c-Fos及下游TGF-β1通路调控神经元OGD模型存活率。方法:1.使用高通量测序检测神经元OGD模型组和LEVs治疗+OGD模型组间miRNA表达情况（重复3次）。2.根据测序结果,选择其中上调表达差异最明显排名前10的miRNA。使用q RT-PCR在以上4组中进行验证,选取差异表达最明显的一个miRNA（miR-101a-3p）作为研究对象,使用q RT-PCR检测LEVs中miR-101a-3p的表达情况,确定LEVs携带miR-101a-3p。通过生物信息学分析miR-101a-3p预测下游靶基因,荧光素酶报告基因检测进一步验证两者关系。3.侧脑室注射miR-101a-3p过表达组（miR-101a-3p agomir）和miR-101a-3p抑制组（miR-101a-3p antagomir）,negative controls（NC）miR-101a-3p agomir和miR-101a-3p antagomir为对照组。C57BL/6小鼠随机分成假手术组、t MCAO/R模型组、miR-101a-3p agomir+t MCAO/R模型组、miR-101a-3p antagomir+t MCAO/R模型组、NC miR-101a-3p agomir+t MCAO/R模型组、NC miR-101a-3p antagomir+t MCAO/R模型组。采用m NSS评分法对小鼠神经功能缺损症状进行评分;TTC染色测定小鼠皮质脑梗死面积。4.小鼠随机分成假手术组、t MCAO/R模型组、miR-101a-3p agomir+t MCAO/R模型组、miR-101a-3p antagomir+t MCAO/R模型组、NC miR-101a-3p agomir+t MCAO/R模型组、NC miR-101a-3p antagomir+t MCAO/R模型组。使用q RT-PCR检测各组脑缺血皮质miR-101a-3p表达情况;应用Western blot技术检测小鼠脑缺血皮质c-Fos和TGF-β1的蛋白表达情况,应用免疫荧光技术检测小鼠脑缺血皮质c-Fos和TGF-β1的表达情况。5.小鼠随机分成假手术组、t MCAO/R模型组、miR-101a-3p agomir+t MCAO/R模型组、miR-101a-3p antagomir+t MCAO/R模型组、NC miR-101a-3p agomir+t MCAO/R模型组、NC miR-101a-3p antagomir+t MCAO/R模型组。应用Western blot技术检测小鼠脑缺血皮质凋亡相关蛋白（Bax、Bcl-2、Total Caspase3和Cleaved Caspase3）表达情况;TUNEL和Neu N双阳性细胞染色技术检测小鼠脑缺血皮质神经元凋亡情况。6.将神经元进行OGD处理后,每组细胞随访分为OGD模型组、miR-101a-3p mimi+OGD模型组、miR-101a-3p inhibitor+OGD模型组、NC miR-101a-3p mimi+OGD模型组、NC miR-101a-3p inhibitor+OGD/R模型组。LDH对细胞存活测定;使用q RT-PCR检测各组miR-101a-3p表达情况;应用Western blot技术检测各组凋亡相关蛋白（Bax、Bcl-2、Total Caspase3和Cleaved Caspase3）及c-Fos和TGF-β1的表达情况;TUNE染色检测神经元凋亡情况。结果:1.LEVs治疗与PBS治疗缺血神经元标本中共有441个miRNA差异表达,其中上调117个,下调324个。2.选择前10个上调的miRNA进行q RT-PCR验证miRNA微阵列分析结果。在OGD诱导的神经元中,与PBS组相比,LEVs治疗组的miR-93-5p,miR-101a-3p,miR-20a-5p和miR-103-3p有差异表达（p＜0.05）。在t MCAO/R小鼠中,与PBS组相比,LEVs治疗组的miR-101a-3p,miR-148b-3p和miR-186-5p有差异表达（p＜0.05）。因此,我们假设LEVs通过改变缺血神经元中miR-101a-3p的表达来发挥神经保护作用。通过miRmap、miRanda、micro T、Pic Tar和PITA数据库预测miR-101a-3p 93个靶基因,通过Target Scan获取到人类、大鼠和小鼠中miR-101a-3p与c-Fos的结合位点,利用双荧光素酶报告法验证miR-101a-3p是否靶向c-Fos,实验结果显示:与mimic-NC+c-Fos-3’UTR-WT组相比,miR-101a-3p mimic+c-Fos-3’UTR-WT组荧光强度显著下降（p＜0.05）;然而在mimic-NC+c-Fos-3’UTR-MUT和miR-101a-3p mimic+c-Fos-3’UTR-MUT组之间荧光强度无显著变化。3.注射miR-101a-3p antagomir增加了梗塞体积（p＜0.05）。用miR-101a-3p agomir治疗显着减少了缺血后3天的梗塞体积（p＜0.05）。m NSS评分显示miR-101a-3p antagomir治疗显著增加了脑卒中后第3天的神经功能缺损（p＜0.05）,而miR-101a-3p agomir的治疗显着改善了神经功能缺损（p＜0.05）。4.通过q RT-PCR分析验证,与用PBS或antagomir-NC相比,miR-101a-3p antagomir处理后miR-101a-3p显著降低（p＜0.05）,与用PBS或agomir-NC相比,miR-101a-3p agomir处理后miR-101a-3p显著增加（p＜0.05）。Western blot结果还显示,miR-101a-3p antagomir治疗后,t MCAO/R小鼠c-Fos和TGF-β1表达升高（p＜0.05）,miR-101a-3p agomir治疗后,c-Fos和TGF-β1表达降低（p＜0.05）。使用免疫荧光检测c-Fos表达情况,miR-101a-3p antagomir治疗显著升高c-Fos+Neu N+细胞的比例,而miR-101a-3p agomir治疗则显著降低了。5.使用Western blot技术检测细胞凋亡相关蛋白的表达情况,与用PBS或inhibi tor-NC相比,用miR-101a-3p antagomir处理显著升高了Bax和Cleaved Caspase3蛋白表达（p＜0.05）,Bcl-2蛋白表达显著减少（p＜0.05）。与用PBS或agomir-NC相比,用miR-101a-3p agomir处理显著降低了Bax和Cleaved Caspase3蛋白表达,Bcl-2蛋白表达显著增加（p＜0.05）。使用TUNEL染色技术检测结果显示,与用PBS或inhibitor-NC相比,用miR-101a-3p antagomir处理显著升高了TUNEL+和TUNEL+Neu N+细胞率（p＜0.05）。与用PBS或agomir-NC相比,用miR-101a-3p agomir处理显著降低了TUNEL+和TUNEL+Neu N+细胞率（p＜0.05）。6.使用LDH测定细胞活力,发现miR-101a-3p inhibitor处理明显降低细胞活力（p＜0.05）,miR-101a-3p mimic处理增加细胞活力（p＜0.05）。此外,q RTPCR检测结果显示,与用PBS或inhibitor-NC相比,miR-101a-3p inhibitor处理后miR-101a-3p显著降低（p＜0.05）,与用PBS或mimi-NC相比,miR-101a-3p mimic处理后miR-101a-3p显著增加（p＜0.05）。通过Western blot技术检测,发现与用PBS或inhibitor-NC相比,miR-101a-3p inhibitor处理后由miR-101a-3p下调引起的c-Fos及TGF-β1表达增加,与用PBS或mimi-NC相比,miR-101a-3p mimic处理后由miR-101a-3p升高引起的c-Fos及TGF-β1表达降低（p＜0.05）。使用Western blot和TUNEL染色分析以检测miR-101a-3p的体外神经保护作用。与用PBS或inhibitor-NC相比,用miR-101a-3p inhibitor处理显著升高了Bax、Cleaved Caspase3蛋白表达和TUNEL+细胞率（p＜0.05）,Bcl-2蛋白表达显著减少（p＜0.05）。与用PBS或mimi-NC相比,用miR-101a-3p mimic处理显著降低了Bax、Cleaved Caspase3蛋白表达和TUNEL+细胞率（p＜0.05）,Bcl-2蛋白表达显著增加（p＜0.05）。结论:1.LEVs治疗改变缺血神经元miRNA的表达。2.LEVs通过改变缺血模型miR-101a-3p的表达调节其下游靶标c-Fos。3.miR-101a-3p调控t MCAO/R小鼠的神经功能。4.miR-101a-3p调控c-Fos及下游TGF-β1。5.miR-101a-3p调控t MCAO/R小鼠的神经元凋亡。6.miR-101a-3p抑制c-Fos及下游TGF-β1通路增加神经元OGD模型存活率。第三部分has-miR-101-3p在急性缺血性脑卒中患者外周血的表达目的:1.研究has-miR-101-3p在正常患者和急性缺血性脑卒中患者的血浆表达情况;2.探索has-miR-101-3p在正常患者和急性缺血性脑卒中患者的血浆表达情况是否受性别影响;3.探讨在急性缺血性脑卒中患者经静脉溶栓前后has-miR-101-3p在血浆中表达情况。方法:1.收集正常患者和急性缺血性脑卒中患者外周血样本并提取血浆放-80°C保存,以及收集临床病例资料。2.使用q RT-PCR检测正常患者和急性缺血性脑卒中患者外周血浆has-miR-101-3p的表达情况。3.统计分析has-miR-101-3p与急性缺血性脑卒中临床相关性。结果:1.与年龄和性别匹配的认知健康对照组相比,急性缺血性脑卒中患者血浆中的has-miR-101-3p水平显着降低（p＜0.05）。2.has-miR-101-3p的表达在男性和女性急性缺血性脑卒中患者血浆中降低,hasmiR-101-3p水平没有基于性别的差异（p＜0.05）3.急性缺血性脑卒中患者血浆中的has-miR-101-3p在接受静脉溶栓后24小时表达上调（p＜0.05）。结论:1.has-miR-101-3p在急性缺血性脑卒中患者血浆中表达降低;2.has-miR-101-3p在男性和女性急性缺血性脑卒中患者的血浆中表达降低;3.has-miR-101-3p在急性缺血性脑卒中经静脉溶栓神经功能恢复后的患者血浆中表达升高。