乳房炎（Mastitis）是奶牛养殖场常见的疾病,引起奶牛乳房炎的病原菌多达150多种,无乳链球菌是主要致病菌之一。此外,该菌对人类和水生动物也存在潜在的危害。为了解四川部分地区奶牛乳房炎病例中无乳链球菌感染情况、分离菌对抗菌药物敏感性、毒力因子携带状况以及对亚单位疫苗进行初步探索。本试验采集四川5个不同地区规模化奶牛场的临床型乳房炎样本进行无乳链球菌的分离培养,运用微生物常规鉴定方法和16S rRNA对分离菌鉴定,并对分离菌血清型、耐药性及毒力基因进行分析。同时,以无乳链球菌enolase蛋白作为抗原蛋白,初步制备针对该菌的亚单位疫苗,用间接ELISA检测免疫小鼠血清抗体水平,验证抗原蛋白免疫原性,为奶牛乳房炎防控及亚单位疫苗的研发奠定基础。1.无乳链球菌的分离、鉴定采集四川5个不同地区的牧场临床型乳房炎乳样共计313份,将乳样接种到含5%脱纤维绵羊血的哥伦比亚血琼脂平板上,结合生化试验和16S rRNA测序对无乳链球菌进行鉴定,并利用多重PCR方法对分离菌血清型进行鉴定。结果表明,经分离培养、生化试验和16S rRNA鉴定,共分离到无乳链球菌105株,分离率为33.55%。血清型多重PCR结果表明,分离菌血清型全部为Ia型。2.无乳链球菌耐药性及毒力基因研究对105株无乳链球菌进行β-内酰胺类（哌拉西林,头孢曲松,青霉素,阿莫西林,头孢他啶）和氨基糖苷类（卡那霉素,庆大霉素,新霉素,链霉素,妥布霉素）共计10种抗生素耐药表型测定。用PCR方法检测β-内酰胺类（TEM,IMP,DHA,OXA）和氨基糖苷类（aph（3’）Ia,ant（3’）I,aac（6’）Ib,aac（3’）Ib）8种耐药基因,并对分离菌bac、cfb、cylE、fbsA、fbsB、hylB、α-enolase、lmb 8种毒力基因进行PCR检测。结果显示,分离菌对氨基糖苷类药物（卡那霉素、庆大霉素、新霉素、妥布霉素）敏感率高达100%,对β-内酰胺类药物（青霉素、阿莫西林、头孢他啶、头孢曲松）耐药率高达98.10%。在所有分离菌中仅检测到β-内酰胺类耐药基因TEM,基本符合耐药表型。毒力基因检测结果显示,所有分离菌均携带cfb、cylE、fbsA、fbsB、hylB、α-enolase毒力基因,bac和lmb未检测到。3.enolase蛋白亚单位疫苗的初步制备通过克隆分离菌enolase基因,构建重组表达质粒pET-32a-enolase,并转入大肠杆菌BL21菌株进行IPTG诱导目的蛋白表达,SDS-PAGE电泳对表达产物进行分析,然后用Ni-NTA柱对重组蛋白纯化,Western-blot验证表达蛋白免疫原性。用纯化的enolase重组蛋白加佐剂后对小鼠进行2次免疫,用间接ELISA方法检测免疫后第14 d,第21 d和第28 d小鼠血清抗体水平,评价enolase蛋白亚单位疫苗对小鼠的免疫效果。测序结果表明,从无乳链球菌（MN686586）中扩增出的enolase基因与Gen Bank公布的enolase基因（KF607046.1）序列同源性在97%以上。成功构建pET-32a-enolas重组质粒,将其转入大肠杆菌BL21经IPTG体外诱导表达,SDS-PAGE电泳分析后获得分子量大小为67 k Da重组蛋白。免疫印迹分析表明重组蛋白具有良好的免疫原性。用enolase亚单位疫苗免疫小鼠,间接ELISA检测小鼠血清抗体水平显示,二免后第14 d小鼠血清抗体水平效价达到1:25600,结果表明enolase亚单位疫苗能够刺激小鼠产生一定的免疫应答和产生特异性抗体,已初步制备出针对牛源无乳链球菌的亚单位疫苗。