非酶式信号放大的核酸传感体系的构建及其应用研究

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信号放大技术是分析检测痕量生物分子的重要研究手段,在生物医学、食品安全、环境监测、分子诊断学、分析化学和法医学研究等领域中具有重要意义。信号放大技术大致可以分为两类:酶促信号放大技术和非酶式信号放大技术。其中,参与酶促信号放大技术的酶主要包括聚合酶、连接酶、核酸酶等,酶的存在不仅能够特异地识别目标序列,同时具有较高的催化能力,但是也存在条件要求严苛、操作过程复杂、价格昂贵等不足,因此发展反应条件温和、操作简单的非酶式信号放大技术,用于各种痕量目标分子的定量分析,在检测研究中显得尤为重要。本论文将非酶式信号放大技术和与光学生物传感器相结合,用于检测癌胚抗原(Carcinoembryonic Antigen,CEA)和铅离子(Pb2+),通过考察传感体系的可行性、灵敏度、选择性以及实际样品的检测能力来评估传感器的基本性能,具体内容如下:第一章:介绍了肿瘤标志物的临床意义及CEA目前的研究进展,介绍了脱氧核酶的概念及其常见应用,同时介绍了几类常见的信号放大技术,并对本论文的研究内容及创新方面进行了阐述。第二章:设计了一个基于杂交链式反应(HCR)和hemin/G-四链体的核酸适体传感器检测CEA。在该传感体系中,CEA核酸适体和HCR引发链(Blocker)杂交形成双链结构。CEA存在时,核酸适体与CEA的特异性结合,将Blocker从双链中竞争下来,引发HCR,hemin存在下形成具有催化活性的hemin/G-四链体,并催化过氧化氢氧化2,2’-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸,此时溶液颜色由无色转变为绿色,并在波长为405 nm时有较强吸光度。在浓度为30-500 ng/mL时,吸光度与CEA浓度表现出良好的线性关系,检测下限达到24.8 ng/mL。此外,该传感器具有较好的选择性,在实际血清样本中对CEA的检测回收率为92.2%~108.6%,效果令人满意。第三章:构建了一种基于脱氧核酶(DNAzyme)的循环放大荧光传感器对铅离子的灵敏检测。在该传感平台中,发夹探针HP-Sub作为底物链,环部上分别修饰了荧光基团和淬灭基团,此时由于二者距离较近产生荧光共振能量转移,荧光被淬灭。DNAzyme作为捕获链,通过碱基互补配对识别到底物链,当加入Pb2+时,发挥其催化活性,实现对底物链切割,使得荧光基团与淬灭基团彼此远离,荧光恢复。同时因为DNAzyme不随反应进行而被消耗、可以进一步参与对下一个底物分子的切割,从而实现荧光信号的循环放大,荧光响应信号有了大幅提升。荧光信号与铅离子浓度呈现较好的线性关系,检测下限达到3.5 nM,同时该传感器不受其它金属离子的干扰,具有良好的选择性。在自来水样本中对Pb2+的检测回收率为96.5%~108.9%,具有潜在的实际应用价值。
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