【摘 要】
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随着全球气候变暖,水资源短缺和土壤盐渍化问题日益严重,耕地区因受干旱和高盐环境的恶劣影响,其作物的平均产量下降高达一半。因此探索具有发挥抗逆性作用的功能基因,将其应用到作物生产,具有极为重要的意义。棉花（Gossypium hirsutum）作为我国重要经济作物之一,其在国民经济中占据着十分重要的地位。然而,干旱、高盐等恶劣环境严重制约着棉花的产量和质量。植物水孔蛋白不仅参与水分的运输,同时在植物
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随着全球气候变暖,水资源短缺和土壤盐渍化问题日益严重,耕地区因受干旱和高盐环境的恶劣影响,其作物的平均产量下降高达一半。因此探索具有发挥抗逆性作用的功能基因,将其应用到作物生产,具有极为重要的意义。棉花（Gossypium hirsutum）作为我国重要经济作物之一,其在国民经济中占据着十分重要的地位。然而,干旱、高盐等恶劣环境严重制约着棉花的产量和质量。植物水孔蛋白不仅参与水分的运输,同时在植物逆境胁迫应答过程也发挥重要作用。本文从棉花中分离鉴定了一个质膜水孔蛋白基因GhPIP1;4,研究了该基因在棉花中的表达模式及其启动子的活性。同时构建了该基因过量表达和RNAi载体分别转化拟南芥和棉花,获得了多个株系的转基因植株。利用转基因植株,对GhPIP1;4在棉花遭受干旱、高盐逆境环境时所发挥的功能进行了研究和探讨,主要结果如下所示:1.GhPIP1;4基因在根中优势表达提取棉花根茎叶等各个组织的RNA,进行Northern杂交实验,结果显示GhPIP1;4主要在棉花根中表达,在下胚轴及花瓣中亦有表达,但表达量较低。后又收集棉花不同发育时期的根,并将根分区,结果显示GhPIP1;4的转录产物主要集中在幼嫩的根中表达,特别是幼嫩的根尖。为进一步确定该基因在根中的表达部位,我们进行了原位杂交实验,结果显示杂交信号主要出现在棉花根尖的维管组织中。综上可知,GhPIP1;4基因主要在棉花根中优势表达,推测可能参与根的水分运输。2.GhPIP1;4启动子活性分析为研究GhPIP1;4基因启动子的活性,我们分离克隆了该基因的启动子并构建了 pBI101-GhPIP1;4p::GUS融合表达载体,转化拟南芥,筛选鉴定了多个稳定表达GhPIP1;4p::GUS的转基因株系。GUS组织化学染色结果显示,GUS信号主要分布在拟南芥的根部。在莲座叶、茎生叶主叶脉上亦能观察到明显的GUS信号,而在茎、荚果、花等器官中未检测到GUS信号。3.GhPIP1;4过量表达转基因拟南芥的鉴定及其在高盐、干旱胁迫下耐受性分析为了研究GhPIP1;4的功能,我们将GhPIP1;4 ORF序列插入pBI121载体,构建了 pBI121-35S::GhPIP1;4过量表达载体,转化拟南芥,获得了多个稳定遗传的异源表达转基因株系。经PCR及RT-PCR检测筛选出GhPIP1;4表达量较高的株系,对其进行NaCl、甘露醇以及干旱处理,观察其表型,并测定植株中生理指标（如SOD、H2O2、POD、MDA、脯氨酸、叶绿素等）的含量,结果发现相较于WT,转基因拟南芥表现出明显的生长优势和对高盐、干旱胁迫一定的耐受性,由此推测GhPIP1;4参与到植物的耐盐抗旱过程,并发挥积极作用。4.GhPIP1;4-RNAi转基因棉花的鉴定及其在高盐、干旱胁迫下耐受性分析为了在棉花中进一步研究GhPIP1;4的功能,我们选择GhPIP1;4基因序列特异性较强的3’-UTR序列构建了 pBI121-35S::GhPIP1;4-RNAi载体,转化棉花。经PCR及RT-PCR检测筛选出GhPIP1;4表达水平明显下降的阳性转基因株系进行胁迫耐受性分析实验。对这些植株进行甘露醇、NaCl及干旱处理,观察其表型,并测定植株中生理指标（如SOD、H2O2、POD、MDA、脯氨酸、叶绿素等）的含量,结果发现相较于野生型,转基因棉花表现出明显的生长劣势和对高盐、干旱和渗透胁迫一定的敏感性,由此推断GhPIP1;4参与到棉花的耐盐抗旱过程,并发挥积极作用。综上所述,棉花GhPIP1;4主要在棉花根中表达,过量表达该基因能明显增加植株的耐盐抗旱性,反之,利用RNAi技术使其表达量下降,则植株对高盐、干旱等逆境胁迫敏感性增加,由此推测,该基因可能参与植物干旱、高盐胁迫应答反应,并发挥正调控作用。
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