论文部分内容阅读
细胞因子是由免疫系统细胞分泌的可溶性信号蛋白质,可用来调节免疫应答反应,在机体的免疫系统中起着重要作用。研究表明,在健康的人体中,细胞因子几乎是不可检测的。但是如果细胞因子的浓度一旦升高则表明与炎症或疾病进展相关的细胞因子通路被激活,机体就会体现不健康的状态。因此,细胞因子的检测在临床应用中具有重大意义。然而细胞因子含量极少（pM范围）、种类繁多,分泌过程十分的短暂,在机体内以复杂的方式彼此相互作用,因此迫切需要研发高灵敏度、高选择性、实时监测的检测方法。电化学生物传感器具有响应速度快、灵敏度高、选择性好、成本低廉等优点,近来受到越来越广泛关注。核酸适配体因其自身的特异性强、亲和力高、易于修饰和功能化等一系列优点,而成为医学,化学、生物科学等领域的研究热点之一,而备受关注。本文利用电化学生物传感器方法结合适配体的结构转换特性构建了实时检测细胞因子IFN-γ的生物传感器。构建的传感器对细胞因子均表现出了较低的检测限和较宽的检测范围,并且实现了对细胞因子IFN-γ的实时检测,在细胞溶液中,具有优良的选择性和稳定性。现将本论文的研究内容概括如下:（1）构建基于适配体修饰的纳米磁珠微流控电化学生物传感器并用于实时检测IFN-γ。首先,通过biotin-streptavidin之间的非共价相互作用将5’端修饰二茂铁分子（Fc）,3’端biotin标记的IFN-γ发夹型的适配体修饰到streptavidin标记的纳米磁珠（MB）上,制备MB-aptamer纳米复合材料。然后用注射器将MB-aptamer纳米复合材料注射到组装的微流控装置中,静置使MB-aptamer纳米复合材料完全吸附到磁性玻碳电极电极表面,构建适配体修饰的纳米磁珠微流控电化学生物传感器对不同浓度的IFN-γ进行定量检测和实时检测。IFN-γ的定量实时检测可根据分析物与aptamer反应后检测到的Fc的电化学信号强弱来实现。结果显示,构建的传感器对细胞因子IFN-γ具有较低的检测限（10 pg mL-1）和宽的线性范围（10～500 pg mL-1）。此外,所制备的微流控装置用样量少,能够在过量血清蛋白存在的情况下特异性的识别IFN-γ,并且允许在不添加外源试剂的条件下连续监测IFN-γ。（2）构建基于适配体结构转换的GO功能化的电化学生物传感器并应用于IFN-γ的检测。首先,运用重氮盐原理,通过C-C键将4-硝基苯修饰到玻碳电极（GC）表面,构建NO2-ph-GC界面,然后用质子溶液（VEtOH:VH2O=1:9）通过电化学将硝基还原为氨基,构建NH2-ph-GC界面。接着将电极浸没在含NaNO2的0.5 M HCl溶液中,将电极表面的氨基重氮化后,再放到含有GO的水溶液中,通过循环伏安法将单层GO通过C-C键修饰到电极上,构建GO-ph-GC界面。通过络合作用和静电引力将Ru（NH3）6Cl3嵌入到IFN-γ发夹型的适配体中,从而制备aptamer（Ru）复合物。然后用EDC/NHS活化GO上的羧基,通过酰化反应将氨基修饰的aptamer（Ru）复合物固载到电极上,构建aptamer（Ru）-GO-ph-GC传感器对不同浓度的IFN-γ进行实时定量检测。由于目标分子IFN-γ可以诱导其适配体结构发生变化,并特异性的结合IFN-γ,使嵌入到适配体结构中的氧化还原分子Ru（NH3）6C13释放出来。IFN-γ的定量实时检测可根据分析物与aptamer（Ru）反应后检测到的Ru（NH3）6C13的电化学信号强弱来实现。结果显示,构建的传感器对细胞因子IFN-γ具有较低的检测限（1.3 pg mL-1）和宽的线性范围（1.3～210 pg mL-1）。和第二章的体系相比较,灵敏度提高了一个数量级。而且,此方法比普遍使用的ELISA灵敏。另外,所制备的传感装置能够在细胞微环境中可以高选择性连续监测IFN-γ。（3）最后,基于第三章工作的研究基础,本章构建了基于适配体载药的刺激响应体系,并成功实现了对IFN-γ的实时检测及同时IFN-γ刺激药物释放。首先,运用重氮盐原理,通过C-C键将4-羧基苯修饰到玻碳电极（GC）表面,构建HOOC-ph-GC界面。然后用EDC/NHS活化电极表面的羧基后通过酰化反应将链酶亲和素（STR）修饰到电极表面,构建STR-ph-GC界面。由于具有芳香族结构的扁平分子能够嵌入到DNA双螺旋结构中,因此通过π-π共轭作用将药物分子阿霉素（DOX）嵌入到IFN-γ发夹型的适配体中,制备aptamer（DOX）复合物。接着将5’端修饰二茂铁分子（Fc）,3’端生物素（biotin）标记的aptamer（DOX）复合物,利用biotin-streptavidin之间的相互作用将aptamer（DOX）复合物固载到电极上,构建aptamer（DOX）-ph-GC传感器对不同浓度的IFN-γ进行定量检测、实时检测以及药物释放。在本工作中,适配体特异性识别IFN-γ引起其结构发生变化,使Fc分子远离电极表面,同时使嵌入到适配体结构中的药物分子阿霉素释放出来。IFN-γ的定量和实时检测可根据分析物与aptamer（DOX）反应后检测到的Fc的电化学信号强弱来实现,药物的释放根据释放的DOX的电化学信号强弱来判断。与前两部分工作不同的是本文的特点在于在实现对细胞因子IFN-γ实时检测的同时,也能根据需求给药,在疾病的精准诊断和治疗中具有广阔的应用前景。