目的：研究新型溶瘤单纯疱疹病毒（Ⅱ型，oHSV2）对结肠癌干细胞和非癌干细胞的杀伤作用，及其对肿瘤细胞自我更新能力、侵袭转移能力、肿瘤细胞周期及凋亡的影响，并与传统化疗药物比较，揭示其溶瘤效应、毒性大小等特点。为溶瘤Ⅱ型单纯疱疹病毒临床用于结肠癌的治疗奠定理论基础。　　方法：采用干细胞培养基成球培养方法获得具有干细胞特性的结肠癌肿瘤细胞（癌干细胞，CSCs），通过传代培养、克隆形成实验、体内成瘤实验及Transwell迁移、侵袭实验证明该群细胞的肿瘤干细胞特性，并通过进一步实验证明oHSV2对CSCs干性抑制作用。通过细胞增殖-毒性实验（CCK-8）、细胞周期与凋亡检测（Annexinn V-FITC/PI）、体内抑瘤及生存期观察等一系列的体内体外实验证明oHSV2及与5-Fu联合对结肠癌的治疗作用。　　结果：干细胞培养基成球培养细胞具有肿瘤干细胞的特性，表现如下：CSCs细胞在相同的培养条件下可以自我更新（传代）；与普通粘附培养结肠癌细胞相比，具有更强的克隆形成能力、体内成瘤能力、迁移能力及侵袭能力。oHSV2可显著削弱CSCs肿瘤干细胞特性。通过CCK-8实验证实oHSV2可明显杀伤结肠癌细胞，且随着MOI的增大及作用时间的延长能导致细胞存活率明显下降。oHSV2联合5-Fu组对结肠癌细胞的杀伤作用明显优于任何单一用药组。细胞周期检测显示oHSV2改变细胞周期结构，可诱导S期细胞增多，G0/G1期细胞减少，而5-Fu诱导S期细胞减少，G0/G1期细胞增多，联合组导致S期细胞增多，G2/M期细胞显著减少。细胞凋亡检测证实病毒可诱导细胞通过坏死和凋亡两条途径死亡，但以坏死为主。体内实验证实oHSV2可明显抑制肿瘤的生长，抑瘤率可达98.54％、96.39%、90.42%（HT-29、SW620、LoVo荷瘤），较单一5-Fu抑瘤效应，联合用药抑瘤率可达83.67%，观察终点oHSV2治疗组及联合治疗组裸鼠重要脏器病理检查未见明显器质性病变，裸鼠体重无差异。Kaplan-Meier生存分析显示oHSV2治疗可显著提高裸鼠的生存率。　　结论：oHSV2可显著削弱结肠CSCs的肿瘤干细胞特性，有效杀伤结肠癌细胞，主要对G0/GI期细胞敏感，可诱导癌细胞S期阻滞，杀伤细胞以诱导其坏死为主。联合5-Fu可协同杀伤处于不同细胞周期的肿瘤细胞。oHSV2可明显抑制体内肿瘤的生长，未见明显副作用，可有效延长生存期，改善预后。联合5-Fu具有协同抑瘤的效应，未见额外增加的副作用。