本文对一种新型的TGF-β 抑制剂增强妇科恶性肿瘤常见化疗药物疗效进行了研究。本研究分为三个部分：　　第一部分：化疗药物活化TGF-β信号通路的研究。　　目的：通过研究妇科恶性肿瘤四种常用的化疗药物，包括顺铂(DDP)，紫杉醇(PTX)，阿霉素（Doxo）以及喜树碱（CPT），观察化疗药物对TGF-β信号通路活性的影响。　　方法：⑴生物信息学技术分析卵巢癌组织化疗前后差异表达的基因，明确TGF-β信号通路在妇科肿瘤化疗中的作用；⑵采用Western blot方法检测顺铂、紫杉醇、阿霉素以及喜树碱等化疗药物处理后，宫颈癌细胞HeLa、C-4I及卵巢癌细胞OVCAR-3、TOV-21G中磷酸化的Smad2（P-Smad2），Smad3（P-Smad3），总的Smad2（T-Smad2），Smad3（T-Smad3）的变化，研究化疗药物对TGF-β信号通路活性的影响；⑶通过两种TGF-β抑制剂，RER（本课题组前期自主设计研发的一种新型的TGF-β配体抑制剂，与受体结合后可以从细胞外阻断TGF-β信号通路）和HTS（一种TGF-βRI的选择性抑制剂），研究化疗药物激活的TGF-β信号通路可否为TGF-β抑制剂所阻断。　　结果：①生物信息学分析发现在卵巢癌组织中TGF-β1及其信号通路分子在化疗后明显上调，而且，与化疗相关的1719个基因中，98.57％的基因受 TGF-β1调控，提示卵巢癌中，TGF-β1及其信号通路是调控化疗反应的关键信号通路；②将顺铂、紫杉醇、阿霉素或者喜树碱分别作用于宫颈癌细胞HeLa细胞、C-4I细胞，卵巢癌细胞OVCAR-3、TOV-21G细胞1h、6h、或者24h后，均观察到磷酸化的Smad2以及Smad3明显增高，但总的Smad2以及Smad3无明显变化，提示化疗药物可以激活TGF-β信号通路；③将RER或者HTS分别作用于四种细胞以后，再与上述化疗药物孵育6h或24h，结果发现化疗药物促进的磷酸化Smad2以及Smad3可被RER或者HTS所阻断。　　结论：宫颈癌以及卵巢癌中，TGF-β1及其信号通路是调控化疗反应的关键信号通路，化疗药物可激活TGF-β信号通路。　　第二部分：常用化疗药物促进TGF-β1产生和分泌诱导肿瘤干细胞的产生。　　目的：研究妇科恶性肿瘤中常用化疗药物激活TGF-β信号通路的机制，同时研究顺铂活化的TGF-β信号通路是否诱导肿瘤干细胞的形成以及上皮间质转化。　　方法：⑴应用qRT-PCR检测OVCAR-3细胞中四种常用化疗药物对TGF-β1以及TGF-β2 mRNA水平的影响；⑵应用ELISA检测OVCAR-3细胞中四种常用化疗药物对肿瘤细胞分泌的总的TGF-β1以及活化的TGF-β1的影响；⑶应用qRT-PCR检测 OVCAR-3细胞中顺铂对肿瘤干细胞标志物 CD44, CD133和ABCG mRNA水平的影响；⑷应用流式分选术检测OVCAR-3细胞中顺铂对肿瘤干细胞亚群CD44+CD133+细胞的影响；⑸应用qRT-PCR检测OVCAR-3细胞中顺铂对上皮间质标志物E-cadherin以及Snail mRNA水平的影响，应用Western blot检测HeLa和C-4I细胞中顺铂对E-cadherin以及Snail表达水平的影响。　　结果：①顺铂，阿霉素以及喜树碱处理组TGF-β1 mRNA水平较对照组明显增高（P＜0.05）,但TGF-β2mRNA水平与对照组比较，无显著性差异（P＞0.05）；紫杉醇处理组TGF-β1以及TGF-β2 mRNA水平与对照组均无明显差异；②四种化疗药物处理组总的TGF-β1量以及活化的TGF-β1量均明显高于对照组（P＜0.05），提示四种常用化疗药物均可促进TGF-β1合成和分泌；③在OVCAR-3细胞中，顺铂处理组肿瘤干细胞标志物CD44, CD133以及 ABCG的mRNA水平明显高于对照组，但顺铂联合 RER或 HTS组中 CD44, CD133以及 ABCG的mRNA水平明显低于顺铂处理组；④顺铂处理 OVCAR-3细胞24h后，流式分选术结果提示，CD133+CD44+细胞群较未处理组增加了20多倍，同时加以RER处理，可使CD133+CD44+阳性细胞百分率从15.6%降低到3.1%；⑤在OVCAR-3细胞中，顺铂处理组E-cadherin的mRNA水平明显下降，Snail的mRNA水平显著增强，顺铂联合HTS或RER处理组E-cadherin的mRNA水平较顺铂组上调，Snail的mRNA的水平较顺铂组下调；在HeLa和C-4Ⅰ细胞中顺铂均可以促进 E-cadherin表达减低，Snail表达增强，这种变化同样可被HTS和RER所阻断。　　结论：常用化疗药物可通过促进肿瘤细胞产生和分泌 TGF-β1，激活 TGF-β信号通路，从而诱导肿瘤干细胞产生以及上皮间质转化。　　第三部分：TGF-β抑制剂RER增加顺铂抗肿瘤活性的体内实验研究。　　目的：体外实验已证实化疗药物促进宫颈癌细胞以及卵巢癌细胞产生和分泌 TGF-β1，活化 TGF-β信号通路，诱导肿瘤干细胞形成以及上皮间质转化。本部分研究通过体内实验进一步证实上述结果，同时研究本课题组自主研发的一种新型的TGF-β抑制剂（RER）阻断TGF-β信号通路后是否增强顺铂抗肿瘤的作用，为解决妇科恶性肿瘤的化疗耐药提供新的实验依据和治疗思路。　　方法：⑴将卵巢癌细胞OVCAR-3接种在35只雌性裸鼠的皮下，观察肿瘤生长情况，记录肿瘤生长的潜伏期和肿瘤生长速度，成瘤后将接种相同细胞的裸鼠根据其肿瘤体积匹配情况并分成六组，分别为对照组，RER组，低剂量顺铂组，低剂量顺铂联合RER组，高剂量顺铂组，高剂量顺铂联合RER组。各组间平均肿瘤体积匹配。对照组：每日一次腹腔注射100μl的PBS；RER组：每日一次腹腔注射5mg/kg的RER；低剂量顺铂组：每周一次腹腔注射2.5mg/kg的顺铂；高剂量顺铂组：每周一次腹腔注射5mg/kg的顺铂；低剂量顺铂联合RER组：每日一次腹腔注射5mg/kg的RER联合每周一次腹腔注射2.5mg/kg的顺铂；高剂量顺铂联合RER组：每日一次腹腔注射5mg/kg的RER联合每周一次腹腔注射5mg/kg的顺铂；顺铂腹腔注射共4次。⑵观察各组肿瘤组织形态学、生长曲线、倍增时间，于29天结束实验，观察局部瘤体的重量、各脏器转移情况；⑶采用qRT-PCR检测各组肿瘤组织TGF-β1,上皮间质标志物snail,肿瘤干细胞标志物CD133,CD44以及ABCG的mRNA水平；⑷采用ELISA方法检测肿瘤组织中活化的TGF-β1的含量；⑸采用Western blot方法检测各组肿瘤组织中P-Smad2以及T-Smad2的水平；⑹采用免疫组织化学法检测各组肿瘤组织中上皮间质标志物Slug,肿瘤干细胞标志物CD133以及CD49f的表达水平。　　结果：①35只裸鼠中，33只裸鼠形成皮下瘤，成瘤率91.4%；②RER联合低剂量顺铂组裸鼠的瘤体体积较单用低剂量顺铂组明显减小，差异有统计学意义（P＜0.05）；RER联合高剂量顺铂组瘤体体积较单用高剂量顺铂组减小，但无统计学差异（P＞0.05）；③低剂量顺铂组磷酸化Smad2表达较对照组明显增强，低剂量顺铂联合RER组P-Smad2表达较低剂量顺铂组明显减弱；④低剂量顺铂组TGF-β1 mRNA水平以及活化的TGF-β1含量均较对照组上调，而低剂量顺铂联合RER组TGF-β1 mRNA水平以及活化的TGF-β1的含量均比低剂量顺铂组明显下调（P＜0.05），提示顺铂促进肿瘤组织TGF-β1转录水平以及活性TGF-β1分泌量；⑤qRT-PCR结果提示低剂量顺铂组Snail、CD44、CD133以及ABCG的mRNA水平较对照组明显增高（P＜0.05），低剂量顺铂组联合RER组Snail、CD44、CD133、以及ABCG的mRNA水平较顺铂组降低；⑥免疫组化结果提示低剂量顺铂组CD49f、CD133以及Slug的表达水平较对照组增高，而低剂量顺铂联合RER组CD49f、CD133以及Slug的表达水平较顺铂组降低。　　结论：RER通过阻断顺铂活化的TGF-β信号通路,逆转顺铂刺激的上皮间质转化、肿瘤干性特征，从而增强顺铂抗肿瘤作用。