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目的：胰腺癌是一种高度恶性、致死的肿瘤，起病隐匿，早期无症状，就诊时多为晚期(80-85％)。目前，化疗是晚期胰腺癌患者主要治疗方案，吉西他滨单药化疗是其一线治疗方法。然而，大多数患者对吉西他滨耐药。对吉西他滨诱导的细胞凋亡抵抗是胰腺癌化疗耐药的机制之一。因而迫切需要找到新的分子治疗靶点，逆转胰腺癌化疗耐药，改善预后。NF-κB和XIAP能抑制各种应激诱发的凋亡，是癌症治疗中潜在的靶点。在胰腺癌细胞中NF-κB或XIAP异常增高，与其化疗抵抗密切相关，但是仅仅抑制NF-κB或XIAP表达不能理想地改善胰腺癌的化疗抵抗。NF-κB是一种遍在转录因子，可以调节XIAP的转录;在内皮细胞中，XIAP也可以调节NF-κB的表达，从而逃避细胞凋亡。我们推测在胰腺癌细胞中NF-κB与XIAP也能相互正向调节，形成正反馈循环，同时表达升高，导致胰腺癌细胞对化疗不敏感。本课题主要研究同时靶向抑制NF-κB以及XIAP的表达对腺癌细胞化疗敏感性的影响及其机制;寻找逆转胰腺癌化疗抵抗的有效分子靶点，改善胰腺癌患者预后。 方法：①体外培养胰腺癌细胞株Mia PaCa-2及Panc-1，用不同浓度的吉西他滨(0.01-100μM)处理，CCK法检测细胞生存，绘制生存曲线，检测吉西他滨的LD50，确定吉西他滨耐药株及敏感株。分两组培养胰腺癌细胞，对照组及吉西他滨处理组，EMSA法检测NF-κB的DNA结合活性，western blot法检测XIAP蛋白表达。②构建靶向作用于NF-κB亚基p65及XIAP的质粒载体(p65-shRNA、XIAP-shRNA)，转染Mia PaCa-2及Panc-1，检测转染率。Real timeRT-PCR法检测p65 mRNA和XIAP mRNA，Western blot检测p65蛋白和XIAP蛋白，检测RNAi对靶基因的抑制情况。③分四组培养胰腺癌细胞Mia PaCa-2及Panc-1，正常培养组、吉西他滨处理组、p65-shRNA载体转染组、p65-shRNA载体转染组联合吉西他滨组，Annexin V法检测各组细胞凋亡。细胞培养及分组处理同前，EMSA法检测NF-κB的DNA结合活性，Western blot法检测XIAP蛋白。④分组培养胰腺癌细胞Mia PaCa-2及Pane-1，正常培养组、吉西他滨处理组、XIAP-shRNA载体转染组、XIAP-shRNA载体转染联合吉西他滨组，Annexin V法检测各组细胞凋亡。Western blot法检测XIAP蛋白，EMSA法检测NF-κB的DNA结合活性。细胞培养及分组同前，搜集细胞，行Western blot检测IKKβ、IκBα蛋白。⑤分组培养胰腺癌细胞Mia PaCa-2及Panc-1，分四组处理:吉西他滨组、XIAP-shRNA载体转染联合吉西他滨组、p65-shRNA载体转染联合吉西他滨组、XIAP-shRNA载体、p65-shRNA载体共转染联合吉西他滨组，AnnexinV法检测各组细胞凋亡。细胞培养同前，EMSA法检测NF-κB的DNA结合活性，Western blot法检测XIAP蛋白。 结果：①Mia PaCa-2吉西他滨LD50约1μM，相应的，吉西他滨对Panc-1的LD50大于50μM，确定Mia PaCa-2为吉西他滨敏感株，Panc-1为吉西他滨耐药株。在Mia PaCa-2和Panc-1中，NF-κB的DNA结合活性及XIAP蛋白表达均增高，且敏感株Mia PaCa-2中的NF-κB活性和XIAP蛋白均比耐药株Panc-1低(P＜0.05)。吉西他滨可以诱导两种细胞中的NF-κB活性增强，XIAP表达增加(P＜0.05)。②p65-shRNA载体、XIAP-shRNA载体、阴性载体可以高效地转染MiaPaCa-2和Panc-1细胞，转染率均在80％以上。p65-shRNA载体、XIAP-shRNA载体对MiaPaCa-2及Panc-1细胞的p65 mRNA抑制率约80％以上(P＜0.05)，对相应蛋白的抑制率均达到80％以上(P＜0.05)，阴性载体对p65、XIAP mRNA及蛋白表达无影响(P＜0.05)。③在敏感细胞Mia PaCa-2和耐药细胞Panc-1中，p65-shRNA载体转染结合吉西他滨较吉西他滨单用，可以增加细胞凋亡率(P＜0.05)，但效果不理想，凋亡率仅达到(19.7±1.9)％、(14.9±1.6)％。P65-shRNA载体介导的RNAi可以有效地抑制吉西他滨诱导的p65蛋白的表达，同时伴随有XIAP蛋白表达下降(P＜0.05)。④XIAP-shRNA载体转染结合吉西他滨处理组，在两种胰腺癌细胞中，均可以增加细胞凋亡率，但凋亡率偏低，分别仅为:(18.6±2.0)％、(11.6±1.3)％。XIAP-shRNA载体介导的RNAi能有效地抑制XIAP蛋白的表达，同时伴有NF-κB DNA结合活性下降、IKKβ蛋白下降、IκBα蛋白增加(P＜0.05)。⑤在敏感细胞Mia PaCa-2和耐药细胞Panc-1中，XIAP-shRNA、p65-shRNA载体共转染结合吉西他滨较XIAP-shRNA载体转染结合吉西他滨或p65-shRNA载体结合吉西他滨处理组，细胞凋亡率显著增加(p＜0.05)，达到:(43.7±4.4)％、(39.2±3.1)％;共转染组的NF-κB DNA结合活性及XIAP蛋白表达均显著下降(p＜0.05)。 结论：①NF-κB和XIAP共表达增高是胰腺癌细胞的化疗耐药的重要因素。②同时靶向抑制NF-κB和XIAP表达较单独抑制NF-κB或XIAP表达更能显著增加胰腺癌细胞的化疗敏感性。