MIF转染宫颈癌SiHa细胞株及对其血管生成作用的影响

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宫颈癌是女性第二大恶性肿瘤,全球发病率仅次于乳腺癌。近年来其发病呈现出明显年轻化的趋势,严重威胁着女性的健康和生存质量。巨噬细胞移动抑制因子(macrophage migration inhibitory factor, MIF)是多效能的细胞因子,在炎症、免疫反应及肿瘤的发展过程中起着关键作用。目前研究认为MIF是重要的促肿瘤因子,与多种肿瘤的侵袭、转移、临床分期及预后密切相关。本课题组前期实验证实与Caski细胞株相比,SiHa细胞株中MIF表达较低,进行体外实验表明MIF可能通过促进宫颈癌细胞增殖、转移、血管生成及抑制宫颈癌细胞凋亡等机制促进宫颈癌的侵袭转移。目的:构建表达绿色荧光的pEGFP-N1/MIF真核表达载体,探讨过表达MIF对宫颈癌SiHa细胞中NF-κB、IL-8、VEGF、MMP9表达的影响,进一步探讨MIF在宫颈癌细胞血管生成中的作用,初步探索MIF通过NF-κB信号通路在宫颈癌发生发展中的作用机制,可能为宫颈癌的诊治提供理论依据。方法:1.化学合成MIFcDNA,设计含Xho Ⅰ和BamHI酶切位点的引物序列,利用PCR方法扩增MIF基因片段,构建人pEGFP-N1/MIF真核表达载体;用脂质体转染法将其转染到宫颈癌SiHa细胞株中,荧光显微镜下观察转染效率,采用ELISA法检测转染前后各组上清液中MIF蛋白的表达,用荧光定量PCR法和免疫细胞化学法检测转染前后各组细胞中MIF mRNA和蛋白表达情况。2.MTT法检测转染前后细胞增殖能力的变化,荧光光定量PCR法和免疫细胞化学法检测转染前后各组细胞中·NF-κB、IL-8、VEGF、MMP9mRNA和蛋白表达情况。3.用NF-κB抑制剂PDTC处理pEGFP-N1/MIF/SiHa细胞,采用MTT法检测抑制前后各组细胞增殖能力的变化,采用免疫细胞化学法检测抑制前后各组细胞中MIF、NF-κB、IL-8、VEGF、MMP9蛋白表达情况。结果:1.经过酶切及DNA测序鉴定证实pEGFP-N1/MIF真核表达载体构建成功。利用脂质体转染pEGFP-N1/MIF/SiHa真核表达载体6h后即可在荧光显微镜下观察到绿色荧光,转染48h后荧光强度最强,转基因效率约为(61±2.0)%;ELISA检测结果显示转染pEGFP-N1/MIF组细胞上清液中MIF蛋白表达明显升高(P<0.05);荧光定量PCR、免疫细胞化学检测结果显示转染pEGFP-N1/MIF组细胞中MIF mRNA和蛋白表达均过表达(P<0.05)。2.MTT实验结果显示转染pEGFP-N1/MIF组细胞增殖能力明显增强(P<0.05);荧光定量PCR、免疫细胞化学检测结果显示转染pEGFP-N1/MIF组细胞中NF-κB、IL-8、VEGF、MMP9mRNA和蛋白表达均过表达(P<0.05)。3. NF-κB抑制剂作用于pEGFP-N1/MIF/SiHa细胞后,MTT实验结果显示转染pEGFP-N1/MIF组细胞增殖能力明显减弱(P<0.05);免疫细胞化学结果显示细胞中MIF、NF-κB、IL-8、VEGF、MMP9蛋白表达均明显下调,与对照组相比差异有显著性(P<0.05)。4. Pearson相关分析显示:MIF与IL-8、NF-κB、VEGF、MMP9之间,NF-κB与IL-8、VEGF、MMP9之间,IL-8与VEGF、MMP9之间均存在正相关(P<0.05)。结论:1.将构建成功的pEGFP-N1/MIF真核表达载体转染宫颈癌SiHa细胞能显著上调细胞中MIF的表达;2.MIF可以明显增强宫颈癌SiHa细胞的增殖能力,并且显著上调细胞中NF-κB、IL-8、VEGF、MMP9mRNA和蛋白的表达;3. NF-κB抑制剂PDTC能显著抑制细胞的增殖能力,并且下调pEGFP-N1/MIF/SiHa细胞中MIF、IL-8、NF-κB、VEGF、MMP9蛋白的表达。4. MIF与NF-κB、IL-8、VEGF、MMP9之间,NF-κB与IL-8、VEGF、MMP9之间,IL-8与MMP9、VEGF之间均存在正相关,提示MIF可能通过促进宫颈癌细胞增殖、血管生成,进而促进宫颈癌发生发展,其机制可能与NF-κB信号通路相关。所以探索MIF通过NF-κB信号通路在宫颈癌血管生成中的作用机制可能为宫颈癌的诊治提供的理论依据。
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