苦参和山豆根均为常用的清热解毒中药,苦参为豆科槐属植物苦参Sophora flavescens的根,山豆根为同属越南槐S. tonkinensis的根及根茎。两种药材药用部位相近,化学成分相似,都含有喹喏里西啶类生物碱、异戊烯基类黄酮和齐墩果烯型三萜等成分,但临床应用却明显不同：山豆根制剂多内服,治疗急慢性咽炎等；苦参制剂多外用,治疗皮肤病和妇科疾病。本课题组曾对苦参和山豆根的生物碱及黄酮部位进行指纹图谱研究,发现两种药材生物碱部位聚类图互相交错,无法区分；而黄酮部位图谱却差异明显,各自归为一类。因此,系统研究两种药材的黄酮成分及其生物活性,可望明确苦参山豆根具有不同药理作用的活性物质基础,为进一步研究开发找到新的方向。本文采用天然药化、分析化学等手段对苦参和山豆根中黄酮类成分进行了系统分离,并对分离得到的黄酮成分进行了细胞毒、抗补体和抗菌等多方面生物活性测试；采用LC/MS对苦参山豆根中黄酮成分进行了定性分析,并测定了其中多个活性黄酮的含量；另外,还考察了苦参山豆根黄酮类成分在人工胃液和人工肠液中的稳定性,主要研究结果如下：1.苦参和山豆根黄酮类成分研究1.1苦参乙酸乙酯部位黄酮成分研究：采用柱色谱和制备薄层色谱等方法从苦参乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部位分离鉴定了29个化合物,其中20个为黄酮成分,它们分别是：光果甘草宁(SF-1)、Sophoraflavanone B(SF-2)、异腐醇(SF-3)、Sophoraflavanone G(SF-4)、苦参酮(SF-5)、Leachianone A(SF-6)、Kushenol T(SF-7).三叶豆紫檀苷(SF-8)、高丽槐素(SF-9)、大豆素(SF-10)、金雀异黄素(SF-11)、芒柄花素(SF-12)、毛蕊异黄酮(SF-13)、野靛黄素(SF-14)、Pseudoindorin(SF-15)、黄腐醇(SF-16)、7,9,2’,4’-四羟基-8-异戊烯基-5-甲氧基查耳酮(SF-17)、苦参啶(SF-18)、降脱水淫羊藿素(SF-19)和7,4’-二羟基黄酮(SF-20)。另外9个其它类型的化合物是：白瑞香素(SF-21)、6,7-二羟香豆素(SF-22)、对甲氧基苯甲酸(SF-23)、单硬脂酸甘油酯(SF-24)、正十五碳酸(SF-25)、正二十五碳酸(SF-26)、正三十烷(SF-27)、豆甾醇(SF-28)、β-谷甾醇(SF-29)。其中SF-15和SF-21为槐属中首次分到,SF-1为苦参中首次分到。1.2山豆根乙酸乙酯部位黄酮成分研究：采用柱色谱和制备薄层色谱等方法从山豆根乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部位分离鉴定了27个化合物,其中的15个为黄酮成分,分别为：异补骨脂甲素(ST-1)、山豆根酮(ST-2)、2-(3-Hydroxy-2,2-dimethyl-8-prenyl-6-chromanyl)-7-hydroxy-8-prenyl-4-chromanone(ST-3)、山豆根色烯素(ST-4)、三叶豆紫檀苷(ST-5)、高丽槐素(ST-6)、大豆素(ST-7)、金雀异黄素(ST-8)、芒柄花素(ST-9)、大豆素二甲醚(ST-10)、5-羟基野靛黄素(ST-11)、槲皮素(ST-12)、芦丁(ST-13)、槲皮苷(ST-14)和7,4’-二羟基黄酮(ST-15)。另外12个其它类型的化合物是：6,7-二羟香豆素(ST-16)、羽扇豆醇(ST-17)、对甲氧基苯酚(ST-18)、对羟基苯甲酸(ST-19)、对羟基苯丙烯酸乙酯(ST-20)、对羟基苯甲酸丙酯(ST-21)、咖啡酸二十二酯(ST-22)、单硬脂酸甘油酯(ST-23)、正二十三碳酸(ST-24)、邻苯二甲酸二异丁酯(ST-25)、豆甾醇(ST-26)、p-谷甾醇(ST-27)。其中化合物ST-10和ST-11为本属中首次分到,ST-1和ST-14为山豆根中首次分到。1.3山豆根正丁醇部位黄酮成分研究：采用柱色谱和制备薄层色谱等方法,从具有抗补体活性的山豆根正丁醇部位(CH50=0.44mg/mL)分离鉴定了6个化合物,其中3个为黄酮类成分：槲皮苷、7,4’-二羟基黄酮和芦丁；另外3个化合物为对羟基苯甲酸、单硬脂酸甘油酯和邻苯二甲酸二异丁酯。上述6个化合物也在山豆根乙酸乙酯部位中分离得到。2.化合物活性研究2.1抗补体活性研究：首次对苦参和山豆根中分离得到的黄酮类成分进行抗补体活性筛选,结果表明高丽槐素、降脱水淫羊藿素、槲皮素、槲皮苷、芦丁、4’,7-二羟基黄酮和芒柄花素等7个黄酮表现出一定程度的抗补体活性(CH50=0.09～1.65mg/mL)。初步构效关系显示,黄酮醇及其苷为抗补体作用的主要黄酮类型。山豆根抗补体作用优于苦参。另外,初步发现不同黄酮成分的抗补体作用靶点具有多样性和差异性,值得进一步深入研究。2.2细胞毒活性研究：对实验中分离得到的黄酮类成分进行细胞毒活性筛选,结果表明山豆根色烯素、光果甘草宁、降脱水淫羊藿素、异腐醇、大豆素二甲醚、金雀异黄素、槐属二氢黄酮G、Kushenol T、槲皮素、山豆根酮和7,9,2’,4’-四羟基-8-异戊烯基-5-甲氧基查尔酮等12个黄酮对A549、HCT-8等多种人肿瘤细胞株均有不同程度的抑制作用,GIso值为2.94～16.37ug/mL。构效关系显示,二氢黄酮和黄酮醇是抗肿瘤作用的主要黄酮类型。苦参细胞毒活性优于山豆根。2.3抗菌活性研究：对实验中分离得到的黄酮类成分进行抗菌活性筛选,目前已发现2个活性良好的黄酮。苦参抗菌作用优于山豆根。3.苦参和山豆根黄酮类成分LC/MS定性分析3.1苦参黄酮成分分析：用LC/MS技术进行检测,通过比较对照品、分析分子量、离子碎片等信息,共鉴定了苦参中24个黄酮类成分,其中11个为二氢黄酮类型,紫檀素、查耳酮、异黄酮类型各3个,另外还有二氢异黄酮、二氢黄酮醇和黄酮醇类型各1个。3.2山豆根黄酮成分分析：用LC/MS技术进行检测,通过比较对照品、分析分子量、离子碎片等信息,共鉴定了山豆根中17个黄酮类成分,其中6个为异黄酮、4个为二氢黄酮、4个为紫檀素,另外还有2个查耳酮和1个黄酮醇。4.苦参和山豆根黄酮类成分含量测定3.1苦参黄酮成分含量测定：采用HPLC法同时测定了21份苦参药材中三叶豆紫檀苷、高丽槐素、苦参酮、槐属二氢黄酮B、槐属二氢黄酮G、苦参啶和异腐醇等7种黄酮类成分的含量,结果表明所有苦参药材均含有前6种黄酮成分,另有17个样本含有异腐醇。苦参主成分为苦参酮(平均含量10.47mg/g,二氢黄酮),另外6种黄酮的平均含量分别为：槐属二氢黄酮G(2.73mg/g,二氢黄酮)、三叶豆紫檀苷(2.05mg/g,紫檀素)、槐属二氢黄酮B (0.59mg/g,二氢黄酮)、高丽槐素(0.56mg/g,紫檀素)、异腐醇(0.14mg/g,二氢黄酮)和苦参啶(0.34mg/g,查耳酮)。苦参黄酮成分含量存在较大的地区差异性,所测7种黄酮的总含量为9.69～36.28mg/g,相差约4倍,平均总黄酮含量为16.89mg/g。3.2山豆根黄酮成分含量测定：采用HPLC法同时测定了17份山豆根药材中三叶豆紫檀苷、高丽槐素、山豆根酮、山豆根色烯素和槲皮素等5种黄酮类成分的含量,结果表明所有山豆根药材均含有前4种黄酮成分,另有12个样本含有槲皮素。山豆根的主要成分为山豆根酮(平均含量2.53mg/g,二氢黄酮),另外4种黄酮成分的平均含量分别为：高丽槐素(1.13mg/g,紫檀素)、三叶豆紫檀苷(0.86mg/g,紫檀素)、山豆根色烯素(0.35mg/g,二氢黄酮)和槲皮素(0.16mg/g,黄酮醇)。山豆根黄酮成分含量存在一定的地区差异性,所测5种黄酮的总含量为3.18-8.25mg/g,平均总黄酮含量为5.05mg/g。5.苦参和山豆根黄酮类成分在人工胃液及人工肠液中稳定性考察HPLC法分别测定苦参和山豆根总黄酮提取部位在人工胃液及人工肠液中0-6h的色谱峰面积值变化,结果显示黄酮成分6h内RSD值(n=5)均小于2.75%,表明苦参和山豆根黄酮成分在胃液和肠液环境中基本稳定,未发生降解和转化。本研究有别于关注苦参和山豆根生物碱成分的传统思路,对这两种药材中黄酮成分的类型、含量及生物活性进行了系统的比较研究,从一定程度上明确了两种药材不同临床应用的物质基础。通过对苦参和山豆根药材中黄酮成分的系统分离和LC/MS定性研究,明确了两种药材黄酮成分结构类型上的差异：苦参中黄酮类成分主要为二氢黄酮类型,另外还有异黄酮、查耳酮和紫檀素等；山豆根中异黄酮、二氢黄酮和紫檀素类型的黄酮类化合物都较多,另外还有查耳酮、黄酮醇和黄酮等。以HPLC法测定了苦参和山豆根中多个活性黄酮成分的含量,明确了两种药材黄酮成分在含量上的差异：苦参中黄酮类成分含量远高于山豆根；苦参主成分为苦参酮,与山豆根差异的成分还有槐属二氢黄酮G、槐属二氢黄酮B、异腐醇和苦参啶；山豆根主成分为山豆根酮,与苦参差异的成分还有山豆根色烯素和槲皮素；这也为完善苦参和山豆根药材的质量控制手段提供了重要依据。通过对苦参和山豆根单体化合物的活性筛选,明确了两种药材在生物活性上的差异：山豆根黄酮成分抗补体活性比苦参强,而苦参细胞毒和抗菌活性均优于山豆根；苦参中具有异戊烯基或薰衣草基侧链取代的二氢黄酮成分显示了良好的抑菌和杀菌作用,这也是其临床上多外用,治疗各种皮肤科及妇科疾病的重要原因。另外,发现的多个具有良好抗补体、细胞毒及抗菌活性的黄酮成分,也为新药研究与开发找到了有价值的先导化合物,对进一步合理开发利用槐属药用植物资源提供了有益的线索。