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人群中的研究已证明:在新生儿期接种乙肝疫苗,能有效预防慢性乙肝病毒（hepatitis B virus,HBV）感染,儿童的乙肝表面抗原（hepatitis B Surface Antigen,HBsAg）流行率已显著下降,HBV感染所导致的青少年人群的肝细胞癌发病及死亡风险也明显降低。但疫苗免疫后10-15年,由乙肝疫苗免疫所诱导产生的抗乙肝表面抗原的保护性抗体（Antibodies against hepatitis B surface antigen,anti-HBs）消失。尽管国内外学者在人群中已开展了多项乙肝疫苗的试验性加强免疫测试,结果发现在anti-HBs阴性的乙肝疫苗接种者中,加强免疫能促进anti-HBs产生,但这仅表示机体存在针对HBsAg的回忆性抗体应答,而非抗病毒免疫力存在的直接证据。与很多肿瘤一样,肝细胞癌通常高发于成人,多种因素可促进HBV感染者的肝癌发生,已有分析发现,肝细胞癌的发病风险在隐匿性HBV感染（occulthepatitis B virus infection,OBI）者中也显著增加。国内外已有的研究发现:疫苗接种人群中存在OBI状态。部分出生于HBsAg（+）母亲的儿童,在新生儿期已接种乙肝疫苗且在儿童期获得完全保护后,在成年后出现HBV感染状态,包括OBI状态。因此,有必要分析新生儿乙肝疫苗免疫后所诱导的保护作用的持久性,及影响保护性抗体生成的可能原因。本研究工作包括两个部分:第一部分:新生儿期接种乙肝疫苗后对隐匿性HBV感染保护作用持久性的人群分析（论著已发表）背景与目的:乙肝病毒核心抗体（Antibodies against hepatitis B core antigen,anti-HBc）阳性状态提示既往可能接触过HBV,但在anti-HBc（+）者的外周血中可检测到HBV DNA片段,提示存在可能的OBI状态。国内外已有的研究发现,在乙肝疫苗免疫者HBsAg（-）/anti-HBc（+）体内能检测到HBVDNA,表明部分疫苗免疫者可能有OBI的发生。由于OBI与多种慢性肝脏疾病包括肝细胞肝癌相关,因此,确定新生儿乙肝疫苗对成年人群的OBI预防效果至关重要。江苏启东县曾是我国HBV高流行地区,为研究新生儿期接种乙肝疫苗对HBV相关的肝脏疾病及肝癌的保护作用,本团队于1983-1990年在启东县开展了启东乙肝干预研究,当时我国农村地区尚无乙肝疫苗的供应。该研究采用整群抽样方法,以农村公社为基础单位,用单纯随机法将入组人群分为新生儿乙肝疫苗免疫组（简称疫苗组）和新生儿未免疫对照组（简称对照组）。其中疫苗组共纳入41 182名儿童,有40 211（97.64%）在出生后24h内、1月龄、6月龄注射了 3剂血源性乙肝疫苗（5μg/剂）。对照组共纳入41 730名儿童,在10岁前未接种乙肝疫苗,当地疾病预防控制中心于2000年对该地区1986年后出生者进行了乙肝疫苗补种,已确认其中的23 368名对照组参与者按0-1-6程序补种了 3针10μg的重组乙肝疫苗。本团队于2008-2012年（研究对象到达19-28岁时）对启东乙肝干预研究的参加者进行了血清学和疾病发生结局随访。本次分析于2018年（研究对象到达28-35岁）开展,是在2008-2012年血清学随访基础上进行,以确定新生儿乙肝疫苗免疫后对隐匿性HBV感染保护作用的持久性。方法与结果:1.研究对象。从2008-2012年随访队列中抽取约10%作为研究对象,通过检测HBV感染血清学标志物、HBV DNA及感染性HBV的基因组,即不完全双链松弛环状DNA（relaxedcircular DNA,rcDNA）,分析该人群的OBI状态。本研究共收集到6 715例血样,其中疫苗组3 615例,对照组3 100例。2.新生儿期接种乙肝疫苗能诱导有效的抵抗HBV感染的免疫保护作用。在成年期（28-35 岁）,疫苗组的 HBsAg 阳性率为 1.58%（57/3 615）,HBsAg（-）/anti-HBc（+）阳性率为 4.70%（170/3 615）,均低于对照组的 7.45%（231/3 100）和 19.48%,（604/3100）（p 均<0.001）。3.新生儿期接种乙肝疫苗者的HBsAg（-）/anti-HBc（+）阳性率,未呈现具有统计学意义的随年龄增加而升高趋势。疫苗组HBsAg（-）/anti-HBc（+）阳性率在28-29岁时为 4.31%（55/1 276）,30-31 岁时为 4.66%（59/1 266）,32-33 岁时为 5.74%（49/853）,但在34-35岁为4.29%（7/163）,未呈现具有统计学意义的增高趋势（P for trend=0.261）。但在对照组,该阳性率由28-29时的17.16%稳定升高到34-35岁的25.67%,具有统计学意义（P for trend<0.001）。4.出生于母亲HBsAg（+）的疫苗接种者HBV感染风险增加。在新生儿乙肝疫苗免疫组中,出生于HBsAg（+）母亲的成年人HBsAg阳性率为8.5%（32/378）,HBsAg（-）/anti-HBc（+）阳性率为10%（38/378）;而出生于HBsAg（-）母亲的成年人HBsAg 阳性率仅为 0.8%（25/3 237）,HBsAg（-）/anti-HBc（+）的阳性率为 4.1%（132/3237）。5.新生儿期接种乙肝疫苗的成年人群中存在OBI状态。在HBsAg（-）/anti-HBc（+）者中,新生儿乙肝疫苗免疫组的HBV DNA阳性率13.08%（17/130）,对照组阳性率4.18%（12/287）。通过检测感染性HBV的基因组（HBV rcDNA）存在状态,在29例HBsAg（-）/anti-HBc（+）/HBVDNA（+）者中检测到 26 例（90%）血浆中存在 HBV rcDNA,由此确认了 HBV的隐匿性感染状态。6.新生儿期接种乙肝疫苗未增加疫苗中和抗体作用位点的HBV S区突变频率。对HBV PreS-S基因进行扩增测序,并分析该区的突变情况,发现在疫苗组所分离到的HBV中,中和抗体作用位点的S区基因“a”决定簇的氨基酸突变频率的并未增加,但Pre S2区R48K存在高频突变,与该地区的OBI感染者的突变情况一致。小结:新生儿期接种乙肝疫苗所诱导的保护作用可持续到至少三十年;但部分疫苗接种的成年人中存在隐匿性HBV感染状态;出生于母亲HBsAg（+）携带者成年后HBV感染风险增加。第二部分:胚胎期HBV暴露对乙肝疫苗抗原滤泡辅助性T细胞产生及抗体应答的影响背景与目的:乙肝疫苗的抗原成分是HBV的包膜蛋白HBsAg,其诱导产生保护性抗体anti-HBs依赖于CD4+T淋巴细胞的辅助。滤泡辅助性T淋巴细胞（T follicular helper cells,Tfh cells）是一类持续表达CXCR5的CD4+T淋巴细胞,其自分泌的白介素21（Interleukin,IL21）能促进自身发育分化。除Tfh细胞外,NKT也是IL-21的重要来源。而发育成熟的Tfh细胞可通过IL21-IL21R,ICOS-ICOSL,CD40L-CD40等促进B淋巴细胞增殖分化,及浆细胞和记忆性B淋巴细胞形成。过去已有的研究已证实,母体内的HBsAg能通过胎盘屏障进入到胎儿羊水和脐带血中,出生于HBV（+）母亲者对多种微生物产物的免疫应答不同于出生于HBV（-）母亲者。因此,我们推测胚胎期暴露于母亲HBsAg,有可能通过影响子代体内针对HBsAg的Tfh细胞的分化产生,进而影响其辅助抗HBs的抗体应答,影响乙肝疫苗的免疫保护效果。方法与结果:1.母亲HBsAg（+）携带状态阻碍新生儿针对HBsAg应答的特异性干扰素γ（Interferon Gamma,IFNy）,IL4和IL21产生型T淋巴细胞的形成。共收集到11例出生于HBV不同状态母亲的新生儿脐带血,根据分娩前2周孕妇外周血的HBV DNA和HBV血清学标志物,将其分为HBsAg（+）/HBV DNA>105 IU/mL组（n=2）,HBsAg（+）/HBV DNA≤105 IU/mL 组（n=5）,和 HBsAg（-）/HBV DNA（-）组（n=4）。分别分离3组脐带血淋巴细胞后,采用5μg/mL的HBsAg刺激培养5天,利用ELISPOT检测HBsAg特性的细胞因子产生型细胞数量。发现出生于HBsAg（+）母亲的新生儿脐带血中HBsAg特异性IFNγ、IL4和IL21产生型T淋巴细胞数目均低于出生于HBsAg（-）母亲者。在母亲HBV DNA>105 IU/mL时,新生儿脐带血中难以检测到IL21产生型T淋巴细胞。2.建立胚胎期暴露于HBsAg的小鼠模型。我们选择与C57BL/6J遗传背景相同,并能持续表达并分泌HBsAg的HBV转基因雌鼠（HBV-mother,HBV-M）,与C57BL/6J野生雄鼠交配。待孕期19-20天时,分离胎肝,收集胎血及羊水并检测HBsAg含量。来自HBV-M的所有F1代（HBV-M/F1）胎鼠的羊水中均可检测到HBsAg,提示该模型在某种程度上可模拟人的胚胎期暴露于HBsAg状态。将从胎肝、胎血及羊水中均检测到HBsAg的F1代小鼠命名为HBV-M/F1+,其HBsAg编码基因片段整合在肝细胞内;将仅在羊水中检测到HBsAg的F1代小鼠命名为HBV-M/F1-,其肝细胞不存在HBV片段,仅在胚胎期的羊水中暴露于HBsAg。3.胚胎期暴露于HBsAg阻碍F1代小鼠Tfh细胞的形成。在HBV-M/F1+和HBV-M/F1-及C57BL/6J野生小鼠4周龄时,每只注射5μg重组乙肝疫苗,通过流式细胞染色分析发现,所有HBV-M/F1代小鼠,特别是HBV-M/F1+的HBsAg特异性CD4+CXCR5+PD-1+Tfh细胞数目以及HBsAg特异性CD4+T淋巴细胞分泌的IL21均低于C57BL/6J野生小鼠（p<0.05）。分离淋巴细胞进行共培养过程中,在加入IL21后,HBV-M F1-小鼠的HBsAg特异性CD4+CXCR5+PD-1+Tfh细胞比例升高,但HBV-M/F1+小鼠的Tfh细胞无明显改变。4.胚胎期暴露于HBsAg能降低F1代小鼠分泌anti-HBs的浆细胞数目。注射一剂5μg乙肝疫苗后,HBV-M/F1组小鼠体内CD4+T淋巴细胞辅助的anti-HBs分泌细胞数目明显低于C57BL/6J组（p<0.01）。然而,分离HBV-M F1-小鼠和HBV-M/F1+小鼠的T细胞和B淋巴细胞与C57BL/6J野生的小鼠的B细胞和T淋巴细胞分别进行共培养,在加入IL21后,来自HBV-M/F1-小鼠的CD4+CXCR5+Tfh细胞可促进野生小鼠的B细胞形成CD138+IgD-浆细胞,而来自HBV-M/F1+小鼠的Tfh细胞对野生小鼠CD138+IgD-形成无明显改变。5.乙肝疫苗的加强免疫增强了 HBV-M/F1-小鼠的anti-HBs应答。每间隔2周对HBV-M/F1小鼠进行乙肝疫苗免疫,以观察加强免疫对小鼠抗体应答影响,尽管在HBV-M/F1+小鼠中检测不到anti-HBs的产生,但HBV-M/F1-小鼠体内anti-HBs 阳性率从第二次免疫后58%（7/12）增加到第三次免疫后92%（11/12）,与C57BL/6J组小鼠的阳性率无统计学差异,分别为58%和100%,但是,HBV-M/F1-小鼠的IgG2a/IgG1比值明显低于C57BL/6J野生小鼠（p<0.01）。小结:胚胎期暴露于HBsAg可阻碍HBsAg特异性的Tfh产生,降低Tfh细胞分泌的IL21而影响浆细胞产生anti-HBs的能力。然而,加强免疫通过一定方式增加IL-21产生,从而改善B细胞针对HBsAg的抗体产生能力,由此增强胚胎期暴露于母亲HBsAg但未感染HBV者的anti-HBs应答。