论文部分内容阅读
目的:糖尿病（Diabetes mellitus,DM）是一种高度流行的代谢性疾病,其致病因素复杂多样、发病机制不清,给社会及患者家庭带来沉重的负担。而血管钙化（Vascular calcification,VC）是2型糖尿病（T2DM）所致心血管病变的关键病理改变,也是其致死和截肢的主要原因。在T2DM血管钙化性病变过程中晚期糖基化终产物（Advanced glycation end-products,AGEs）扮演了重要的角色。因此,本研究采用AGEs诱导离体人血管平滑肌细胞（Human aortic smooth muscle cells,HASMCs）钙化,探究此过程中HASMCs是否发生成骨细胞转化、自噬、凋亡以及相关胞内信号的活化情况。进一步采用敲除自噬相关基因7（Atg7）的HASMCs、自噬抑制剂Wortmannin（WM）与AGEs进行体外培养,深入探讨自噬在AGEs诱导HASMCs钙化这一病理过程中的作用及其机制。方法:1:选择3-8代体外培养的HASMCs作为研究对象,细胞于专用培养基中与不同浓度梯度的AGEs（0 mg/L、25 mg/L、50 mg/L、100mg/L）共培养,采用Von Kossa染色确定经不同浓度AGEs处理14d后HASMCs Ca2+沉积的程度。进一步采用免疫荧光染色结合免疫印迹法（Western blot）观察成骨细胞标记物骨桥蛋白（Osteopontin,OPN）在不同浓度的AGEs（0mg/L、25 mg/L、50 mg/L、100mg/L）处理后24h后的表达情况。此外,Western blot检测了不同浓度AGEs处理24 h后的HASMCs内AGEs受体（RAGE）、β-catenin、runt相关转录因子（Runx2）以及成骨细胞化相关蛋白的表达水平,成骨相关蛋白包括:护骨素（Osteoprotegerin,OPG）、基质金属蛋白酶7（Matrix metalloproteinase,MMP7）、骨形成蛋白2（Bone morphogenetic protein,BMP2）。2:为观察AGEs对HASMCs自噬的影响,将HASMCs与不同浓度AGEs共培养24 h后,采用Western blot检测自噬相关蛋白LC3-II、beclin1、p62以及p-m TOR的表达情况。此外,进一步采用免疫荧光观察各AGEs浓度处理HASMCs后LC3点状结构的细胞表达情况。3:为观察AGEs是否诱导HASMCs细胞凋亡,将HASMCs与不同浓度AGEs共培养24 h后,采用Western blot检测凋亡蛋白半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）、半胱氨酸蛋白酶-9（caspase-9）、Bax、Bak的表达情况。此外,采用Annexin V-PI流式细胞术进一步明确HASMCs细胞凋亡的凋亡情况。4:在自噬抑制剂wortmannin（WM）（1μM）预处理HASMCs 1h的基础上,再与100mg/L AGEs共培养24 h后,Western blot检测自噬标记蛋白LC3-II、Beclin1、P62、p-m TOR以及凋亡标记蛋白Bak、Bax、caspase-3、caspase-9和α平滑肌肌动蛋白（α-Smooth muscle actin,α-SMA）的表达情况,免疫荧光染色检测胞内LC3点状结构及细胞肌动蛋白（F-actin）的表达及定位。5:在WM（1μM）预处理HASMCs 1 h的基础上,再与100mg/LAGE共培养24 h后,Von Kossa染色及FLIPR calcium 6染色观察在HASMCs胞内外钙水平。6:构建Atg7敲除的HASMCs,基因型和野生型HASMCs分别用100mg/L AGE处理24 h,Western blot自噬相关蛋白:LC3-I、LC3-II、Atg7以及钙化相关蛋白β-catenin、OPN、BMP2、Runx2和凋亡相关蛋白caspase 9、caspase 3、Bax、Bak的表达水平。结果:1:Von Kossa及免疫荧光染色结果表明,AGEs呈剂量依赖性地使HASMCs的Ca2+沉积及OPN的表达增加,此外,晚期糖基化终末产物受体（AGE receptor,RAGE）、β-catenin、OPG、MMP7、BMP2在25 m g/L、50 mg/L、100mg/L AGEs处理后HASMCs中的表达水平均显著高于空白对照（0 mg/L AGEs）（P<0.05）。2:免疫荧光染色提示AGEs呈剂量依赖性地增加HASMCs中LC3点状结构在细胞内的表达表达;此外,自噬相关蛋白LC3-II、beclin1在25 mg/L、50 mg/L、100mg/L AGEs处理后HASMCs中的表达水平均显著高于空白对照（0 mg/LAGEs）（P<0.05）,而25 mg/L、50 mg/L、100mg/L AGEs处理后的HASMCs中p62以及p-m TOR的表达则显著低于空白对照（P<0.05）。3:凋亡相关蛋白caspase-3、caspase-9、Bax、Bak在25 mg/L、50 mg/L、100mg/LAGEs处理后HASMCs中的表达水平均显著高于空白对照HASMCs（0 mg/L AGEs）（P<0.05）;此外,流式细胞术凋亡染色结果表明AGEs呈剂量依赖性地增加HASMCs的凋亡率,相比于空白对照,25 mg/L、50 mg/L、100mg/LAGEs处理后HASMCs凋亡率均显著增加（P<0.05）。4:1μM WM预处理后可显著抑制AGEs诱导的自噬及凋亡,在AGEs与HASMCs共培养24 h之前,相比于未添加WM的HASMCs,WM预处理可使LC3-II、Beclin1的表达显著降低而增加P62、p-m TOR的表达（P<0.05）;同样地,免疫荧光染色结果也提示WM的显著抑制了AGEs诱导的LC3-II表达上调（P<0.05）;此外,AGEs诱导的凋亡相关蛋白caspase-3、caspase-9、Bax、Bak的表达上调也受到WM的显著抑制（P<0.05）。5:1μM WM预处理后可显著抑制AGEs诱导的表型转化及钙化。在AGEs与HASMCs共培养24 h之前,相比于未添加WM的HASMCs,WM预处理可使α-SMA、β-catenin、OPN、BMP2及Runx2的表达显著下调（P<0.05）;此外,免疫荧光、Von Kossa染色及FLIPR calcium 6染色提示WM显著抑制AGEs诱导的HASMCs中Ca2+沉积及F-actin下调（P<0.05）。6:经100mg/L AGEs处理后,相比于野生型HASMCs,Atg7敲除的基因型HASMCs中自噬相关蛋白LC3-I、LC3-II、Atg7以及钙化相关蛋白β-catenin、OPN、BMP2、Runx2和凋亡相关蛋白caspase 9、caspase 3、Bax、Bak的均明显降低（P<0.05）,说明抑制自噬可使抑制AGEs诱导HASMCs凋亡及钙化。结论:1.在AGEs诱导的血管平滑肌细胞钙化这一病例过程中,所涉及的相关机制包括AGEs诱导血管平滑肌细胞自噬、凋亡及成骨细胞化。2.AGEs诱导血管平滑肌细胞自噬、凋亡及成骨细胞化的过程中,始动因素可能是AGEs诱导的自噬,从而进一步导致血管平滑肌细胞的凋亡及钙化。3.自噬抑制剂或自噬相关基因Atg7敲除可抑制HASMCs中AGEs诱导的自噬、钙化和凋亡,进一步证实AGEs诱导的自噬可能是HASMCs钙化和凋亡,也说明抑制自噬可使血管平滑肌细胞免于AGEs诱导的钙化及凋亡。